flt-1胞外ⅲ区蛋白的可溶性表达、纯化及活性测定

本研究旨在克隆和表达人血管内皮生长因子受体-1胞外ⅲ区蛋白,并测定其生物学活性。应用rt-pcr法从人脐静脉内皮细胞中克隆flt-1胞外ⅲ区基因片段,经测序鉴定后再克隆到原核表达载体payz中,构建出的表达载体payzflt-1ⅲ转化大肠杆菌16c9后,用低磷培养基诱导表达目的蛋白;采用e-tag亲和层析柱纯化目的蛋白;用sds-page、westernblotting和bca法对其进行定性、定量检测鉴定;用elisa、损伤愈合试验和transwell法检测靶蛋白生物学活性。克隆的flt-1胞外ⅲ区基因经测序鉴定正确。所构建的paflt-1ⅲ表达载体经低磷培养基诱导后高表达出可溶性flt-1胞外ⅲ区蛋白,产量约为1.1mg/l;elisa结果显示该蛋白可以结合vegf165,并表现为剂量依赖性,其与配体结合的解离常数kd为1.180pmol/l。损伤愈合试验和transwell结果显示该蛋白可以抑制vegf165(50ng/ml)和bfgf(100ng/ml)诱导的脐静脉内皮细胞的迁移,并呈剂量依赖性。这将为今后开展人flt-1基因ⅲ区的功能研究及其单抗研制奠定了实验基础。