重组gip蛋白的原核优化表达及其生物活性的研究

葡萄糖依赖性促胰岛素多肽或抑胃肽(glucose-dependentinsulinotropicpolypeptideorgastricinhibitorypeptide，gip)是由42个氨基酸组成的胃肠调节肽，在高血糖背景下能够刺激胰岛素释放，能够抑制胃酸分泌、促进神经细胞增生，具有广泛的临床应用价值.化学提取或人工合成gip，成本过高，不宜规模化生产，故应用基因工程技术研制重组人gip(rhgip)并探讨其生物活性有积极的现实意义.人工合成具有大肠杆菌偏爱密码子的编码gip成熟肽的cdna序列，利用pet32a(+)系统进行原核表达；在小规模发酵条件下，进行优化诱导表达和目的蛋白的亲和纯化；通过检测sd大鼠胃酸分泌和血糖浓度，对纯化后的rhgip进行生理活性研究；通过形态学观察和培养基中no含量测定，检测rhgip对pc12细胞no自由基生成量的影响；应用aβ25-35加入培养基造成pc12细胞神经损伤模型，分别以高、中、低剂量rhgip作用于此模型，通过mtt(2-(4,5-dimethylthia-zol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)法测定pc12细胞的活性.结果显示，成功克隆了人gip基因，诱导表达的rhgip占细胞总蛋白质的35%，部分可溶，部分以包涵体形式存在.经过诱导表达的重组蛋白质分子质量约为26ku，与理论值相符.纯化后的rhgip具有免疫活性.优化诱导表达条件为表达菌生长密度a600值0.50，iptg浓度0.5mmol/l，温度37℃，诱导表达时间4h.裂解上清液经固定化金属亲和层析一步法层析后，表达的水溶性rhgip融合蛋白的最后得率为1.2mg/l菌液，纯度为85%.纯化后的rhgip能够使sd大鼠胃液ph值增高，其抑制胃酸分泌作用与生理盐水对照组比较差异有显著性(p<0.05)，而rhgip组和标准品gip组比较差异无显著性.在高血糖背景下，注射rhgip15min后，大鼠血浆血糖浓度较基础血糖显著降低(p<0.05)，30min时与单独注射葡萄糖的模型对照组比较，差异无显著性，而rhgip组和标准品gip组其差异不显著.在rhgip对神经细胞的营养和对pc12细胞免受神经损伤和缺氧损伤影响的研究中发现，用rhgip培养pc12细胞32h后，rhgip组no含量极显著低于正常对照组(p<0.01)，细胞存活较多，神经突起延伸较好，中、高剂量rhgip组均较神经损伤和缺氧损伤组活性显著升高(p<0.05)，且细胞活性呈剂量依赖关系，rhgip组与标准品gip组差异不显著，与正常对照组亦无显著差异.研究结果表明，已得到高效表达的rhgip融合蛋白，该蛋白质具有免疫活性，具有抑制胃酸分泌和降低大鼠血浆血糖浓度的生理活性，并且对神经细胞有营养和保护作用.