人食管癌cdna酵母杂交文库的构建与鉴定及其应用

以往在研究由促癌物12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酯（12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate,tpa）诱导的人永生化食管上皮细胞恶性变中基因的差异表达情况时，曾获得中性粒细胞明胶酶相关lipocalin（neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,ngal）等新的食管癌癌变相关基因.为深入研究这些癌变相关基因在食管癌中以蛋白质-蛋白质或蛋白质-dna相互作用为基础的功能网络调控关系，建立了一个食管癌cdna酵母杂交文库.采用trizol试剂从一种新的人食管癌细胞（sheec，由人永生化食管上皮细胞转化而来）中提取细胞总rna，采用oligotexmrnakit从细胞总rna中制备polya+mrna，采用superscripttmchoicesystemforcdnasynthesiskit合成cdna，以polya+mrna为探针，化学发光法监测cdna合成的质量，以pgadt7为载体构建了sheec细胞的cdna酵母杂交文库.文库的滴度为1.19×109cfu/ml，重组片段大小主要集中在0.5～6.0kb，重组率为50％.在此基础上，应用酵母单杂交技术手段对该文库中的nf-κb元件结合因子进行了筛选，在sd/-his/-leu/［＋15mmol/l3-at］缺陷培养基平板上共获得了约360个单克隆.按照平板上酵母单克隆直径的大小，选择直径大于2mm者91个，提取质粒进行酶切鉴定和一对一酵母单杂交验证实验，结果获得了30个阳性重组子，并随机取其中的9个阳性重组子进行测序和genbank/blast同源分析，发现某些基因编码的蛋白质产物在关键氨基酸残基位点上与p65和p50的nf-κb元件结合域公共序列具有高度一致性.这些实验结果表明，所构建的人食管癌cdna酵母杂交文库是成功的.