家蚕真核细胞翻译起始因子(bmeif4e)基因的克隆、表达及功能分析

？本研究从自建的家蚕(bombyxmori)蛹期cdna文库中筛选到一条cdna序列，发现其在序列和结构上与其他物种的真核细胞翻译起始因子4e基因(bmeif4e)具有较高的相似性，推测可能是家蚕eif4e基因，将该序列命名为bmeif4e，genbank登录号为dn443192。为研究bmeif4e的生物学功能，将该基因插入原核表达载体pet-28a(+)中，构建重组质粒pet-28a(+)-bmeif4e，转化感受态细胞bl21(de3)，iptg诱导表达并纯化该重组蛋白，制备多克隆抗体。利用家蚕bm5细胞进行亚细胞定位研究结果表明，bmeif4e既存在于细胞质中也存在于细胞核中。荧光定量pcr和westernblot分析结果表明，在不同组织及发育时期该基因的表达有差异，在各组织中bmeif4e表达量从高到底依次是马氏管、表皮、脂肪体、气管、卵巢、中肠、头和丝腺；在卵、幼虫、蛹和蛾4个发育时期中，蛾中的表达量最高，其次是蛹，再次是五龄幼虫，而在卵中表达量较低。以该基因的orf为模板体外转录dsrna，脂质体法转染bm5细胞，72h后提取细胞总蛋白作westernblot检测rna干扰情况，发现bmeif4e基因被干扰后，总蛋白中目的蛋白含量明显低于阴性对照组。mtt法检测结果表明，干扰后细胞活力也明显下降。研究结果提示，bmeif4e作为一种重要的管家基因，在家蚕的整个生命周期中均有表达，起着十分重要的作用。