拟南芥alpha-dioxygenase2(atdox2)在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

？为了获得具有生物活性的拟南芥(arabidopsisthaliana)alpha-dioxygenase2(atdox2)，将其对应基因atdox2编码区克隆到酵母表达载体ppic9k中，获得重组表达载体ppic9k-atdox2，将线性化的重组载体电击转化入毕赤酵母(pichiapastoris)表达菌株gs115，经g418筛选、pcr鉴定和甲醇诱导时间优化，获得重组atdox2的高效表达菌株gs115/ppic9k-atdox2。sds-page分析结果显示，0.5%甲醇诱导96h重组蛋白表达量最高，其表达量占胞外总蛋白的15%。重组atdox2的表观分子量约为70kd，经ni-nta柱亲和层析可获得纯度大于80%的重组蛋白。2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)(abts)法测定结果表明重组蛋白具有过氧化物酶活性，且其活性受ca2+和mg2+激活，受edta、咪唑和mn2+抑制；2,4-二硝基苯肼(2,4-dnp)法测定结果显示，重组atdox2具有双加氧酶活性，ca2+对其双加氧酶活性也有激活作用。结果说明利用酵母表达系统获得了具有活性的重组atdox2，atdox2同时具有过氧化物酶活性和双加氧酶活性。