瘤胃细菌群落多样性研究中变性梯度凝胶电泳(dgge)方法的优化

？为了提高瘤胃细菌多样性研究中变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,dgge)方法的准确性，本研究对dgge的最佳变性剂梯度范围、pcr扩增程序和pcr产物处理方法进行了优化。设计dgge变性剂浓度梯度为35%~70%、40%~60%和55%~65%，分别利用一步pcr和修补pcr(reconditioningpcr)对瘤胃细菌16srdna进行扩增；pcr产物分别经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denaturedpolyacrylamidegelelectrophoresis,d-page)和绿豆核酸酶纯化；之后对dgge凝胶图谱聚类分析，并选取部分dgge条带割胶测序。结果表明，dgge的变性剂浓度为40%~60%时，dgge图谱中条带分离效果较好。修补pcr结合d-page纯化在一定程度上可减少pcr产物中的单链dna(single-strandeddna,ssdna)。通过聚类和条带割胶测序分析发现，不同处理方法条件下dgge图谱条带分布不同，dgge凝胶图谱中的单一条带并不能代表是单一菌种。本研究在用dgge对瘤胃细菌群落多样性分析时使用40%~60%凝胶变性剂浓度，并用修补pcr结合d-page纯化样品dna可获得最佳效果。研究结果为瘤胃微生物样品dgge分析提供了参考资料。