牛nanog基因克隆及其在皮肤成纤维细胞中的表达

？本研究克隆了牛nanog基因，构建其真核表达载体，并转染皮肤成纤维细胞，获得能够用作核移植供核细胞的稳定转染细胞株。从6周龄的胎牛原始生殖嵴中提取总rna,通过rt-pcr扩增nanog基因，将其克隆到pmd-18t载体，再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片段，定向克隆到pcdna3-flag表达载体上，挑选序列正确的真核表达质粒pcdna3-nanog转染牛皮肤成纤维细胞，获得了稳定转染的细胞株。用rt-pcr和westernblotting分别检测nanogmrna和flag-nanog融合蛋白的表达，用免疫染色法验证该细胞株是否具有干细胞特征。结果表明：（1）从胎牛原始生殖嵴中克隆了序列正确的nanog全长编码序列；(2)所构建的pflag-nanog重组质粒能够在皮肤成纤维细胞中高效表达；(3)所获稳定转染的细胞株能表达es细胞表面抗原ssea-4和多能性维持因子nanog、oct4，表明其具有一定的多能性。为进一步研究nanog基因功能,尤其是探讨它在家畜早期胚胎发育、生产转基因动物，以及胚胎干细胞建系中的作用奠定了基础。