三黄鸡cd154基因的克隆、序列分析与表达

？cd154在抗原特异的t淋巴细胞和抗原提呈细胞的相互作用中发挥非常重要的作用。利用rtpcr方法从三黄鸡的外周血单核细胞（pbmc）中克隆了鸡cd154基因全长cdna，序列分析显示该基因cdna全长819bp，可编码272个氨基酸。将克隆的鸡cd154全长cdna克隆到原核表达载体pet-28a中获得表达质粒pet-28a-cd154，转化bl21(de3)后未检测到特异性表达蛋白。进一步通过pcr获得去除信号肽(1～22aa)和跨膜区(23～46aa)的cd154基因片段（cd154d），并将其克隆到pqe80的6×his下游，在大肠杆菌中成功表达，获得分子量约27ku的融合表达蛋白6×his-cd154d。western-blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×his的单抗发生特异性反应。同时，将cd154基因全长cdna插入真核表达载体pegfp-c1的egfp基因下游，获得真核表达质粒pegfp-cd154，转染hela细胞，荧光显微镜观察发现egfp-cd154融合蛋白表达在细胞膜上，证实了鸡cd154的膜定位特性。本研究为进一步研究鸡cd154的结构与功能及其免疫佐剂效应奠定了基础。