大鼠IP3R1miRNA慢病毒表达载体的构建及其沉默效应鉴定

目的？构建大鼠IP3R1miRNA慢病毒表达载体，并利用PC12细胞株观察其对IP3R1基因的沉默效应。方法？？根据已公布的IP3？？R1基因序列（GenBankNo.NM_001007235），设计并合成4对miRNA的OligoDNA（miRNA1、miRNA2、miRNA3和miRNA4），退火形成双链DNA后，与载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR连接，构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-IP3R1表达载体;用Gateway技术将该表达载体先后与中间载体pDONRTM221、慢病毒载体pLenti6/V5-DEST连接，构建慢病毒表达载体pLenti6/？V5-DEST-IP3R1，包装产生慢病毒，收集上清，感染PC12细胞株，用Real-timePCR和Westernblotting技术检测慢病毒表达载体对？PC12细胞内IP3R1表达的沉默效应。结果？？测序结果表明，4对pcDNATM？6.2-GW/EmGFP-miR-IP3R1表达载体序列与参考序列一致，将重组获得的慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-IP3R1转染至PC12细胞株，48h后IP3R1的mRNA和蛋白表达下调，以miR-？NA2和miRNA3的沉默效应最佳。结论？？成功构建了大鼠IP3R1慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-IP3R1，其可使大鼠PC12细胞株IP3R1表达下调，为利用RNA干扰技术进一步研究细胞内钙释放通道的功能奠定了基础。