黑暗链霉菌DNA同源重组系统的构建

以黑暗链霉菌Tt-49基因组为模板,利用PCR方法,扩增安普霉素生物合成关键基因aprF-G的上、下游序列,作为同源交换臂,并将红霉素抗性基因筛选标记及其启动子插入两交换臂之间,以温敏型质粒pKC1139为基础,构建用于阻断黑暗链霉菌Tt-49安普霉素生物合成的重组质粒pFD8。该质粒通过E.coliET12567/pUZ8002去甲基化修饰后,经接合转移进入黑暗链霉菌Tt-49,利用红霉素抗性筛选得到3株阳性转化子,分别命名为Tt-49AG1、Tt-49AG2和Tt-49AG3。通过PCR鉴定,证明pFD8已插入黑暗链霉菌Tt-49基因组的目标位点。以亲株作对照,对3株工程菌进行红霉素抗性能力考察,发现3株工程菌的抗红霉素能力均高达1000μg/mL以上。