靶向COX-2基因短发夹RNA重组表达载体的构建及鉴定

目的利用RNA干扰技术，以COX-2为靶基因，构建靶向COX-2基因的短发夹RNA（shRNA）重组表达质粒并进行鉴定分析。方法设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列，经退火形成互补双链，通过定向克隆至质粒pGenesil-1，构建shRNA真核表达载体。转化JM109大肠杆菌，提取质粒进行酶切鉴定和测序分析；RT-PCR和Westernblot检测重组表达质粒对COX-2mRNA和蛋白表达的抑制效果。结果酶切证实目的DNA定向克隆至载体上，测序分析结果与目的序列相同。RT-PCR和Westernblot结果显示，与未转染组比较，pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响，而对COX-2有明显抑制作用。COX-2mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9％和50.3％。结论成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达。