慢病毒介导的CYP3A11基因knock-down小鼠的建立

目的构建和筛选小鼠P4503A11基因miRRNAi慢病毒载体，建立CYP3A11基因knock-down小鼠。？方法利用RaviSachidanandam’sLab的在线软件设计沉默小鼠P4503A11基因的miRNA所对应的shRNA序列，PCR扩增后克隆到PCI-GFP-MiR质粒中，其再与慢病毒载体FUW进行重组。将psPAX2和pMD2.G两个载体和FUW-GFP-MiR-shRNA重组慢病毒载体共转染293FT细胞，包装成病毒。用包装好的病毒液感染293FT细胞后，并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定。将上述重组慢病毒载体分别转染FVB/N小鼠肝细胞，转染48h后，检测P4503A11基因mRNA表达水平的变化。选取干扰效果最好的FUW-GFP-MiR-shRNA1重组慢病毒载体进行制备基因knock-down小鼠模型。用显微注射法将浓缩的shRNA1病毒液注射至FVB/N小鼠12细胞期胚胎透明带下。将注射后发育至22细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠。在紫外光照射下利用滤光片观察GFP在小鼠活体内的表达水平。结果DNA测序结果显示3个重组慢病毒载体均与所设计的shRNA序列一致。检测的3个浓缩前慢病毒悬液的滴度均≥106TU/ml，经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化，其滴度达到109TU/ml以上。转染FUW-GFP-MiR-shRNA1、2的2组肝细胞的P4503A11基因mRNA表达水平相对于空白对照组均显著下降（P<0.05），而转染阴性对照FUW-GFP-MiR-shRNA-NC的肝细胞P4503A11基因mRNA表达水平相对于空白对照组无明显改变。选用FUW-GFP-MiR-shRNA1慢病毒载体制备的F0代3A11基因knock-down小鼠，在紫外光照射下，阳性小鼠可见较强的荧光。结论构建并筛选出小鼠P4503A11基因有效的靶向miRRNAi慢病毒载体，并成功建立CYP3A11基因knock-down小鼠。？