肺炎链球菌dnaJ基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究

目的构建肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae,S.pn）dnaJ基因缺陷菌株，并对其毒力作初步研究。方法采用长臂同源多聚酶链式反应（longflankinghomologypolymerasechainreaction，LFH-PCR）技术将？dnaJ？基因替换为红霉素耐药基因（erm）后同源重组于肺炎链球菌，在含红霉素的血平板上筛选出dnaJ缺陷菌株。用PCR鉴定缺陷菌株，以细菌的吸光度值D(600nm)观察体外缺陷菌株生长情况。将44只BALB/c小鼠采用随机数字表法分为2组，分别用野生菌株和缺陷菌株处理，腹腔攻毒100μl高（2×108cfu）、低（2×106cfu）剂量的菌液，各处理组的不同剂量组均有11只小鼠。记录小鼠死亡时间，计算存活率。60只BALB/c小鼠采用随机数字表分为2组，分别鼻腔滴注含菌量为2×107cfu的30μlD39菌液和△dnaJ菌液，感染后6、12、24、36、48h处死每组中的5只小鼠，分别取鼻咽灌洗液、肺组织（匀浆）和心脏血培养，根据每组平均菌落计数结果绘制细菌在宿主体内的定植曲线。结果PCR结果显示dnaJ基因完全被erm基因所替代，构建dnaJ缺陷菌成功；单个菌落培养基生长情况表明体外热休克状态抑制dnaJ缺陷菌生长；小鼠毒力实验显示腹腔感染缺陷菌株的小鼠存活率可达到100%，而感染野生菌株的小鼠全部死亡，两者比较有统计学差异(P<0.01)。小鼠鼻腔感染模型中，缺陷菌株在各时间点鼻咽灌洗液和肺部的细菌载量均显著低于野生菌株，而且入血后可在感染24h内被宿主清除，上述差异有统计学意义(P<0.01)。结论采用LFH-PCR技术作基因突变完全替代dnaJ基因，方法简便快捷；dnaJ的缺陷影响细菌在体外应激条件下的生长，并显著降低细菌在宿主体内的毒力和定植。