Luffin-β-KDEL-uPAcs融合毒素的构建及其抗胃癌SGC-7901细胞的活性研究

目的　　　构建含尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinaseplasminogenactivator，uPA）裂解位点（uPAcs）和KDEL（Lys-Asp-Glu-Leu）驻留信号序列的丝瓜毒素(Luffin-β)基因的原核载体，表达并纯化其融合毒素蛋白Luffin-β-KDEL-uPAcs（LKP），并探讨融合毒素蛋白LKP抗胃癌SGC-7901细胞的活性。　　　方法　　　RT-PCR两步法克隆Luffin-β基因，引物延伸法构建Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因并亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中，诱导其表达融合蛋白Trx-EK-Luffin-β-KDEL-uPAcs（TELKP）并纯化TELKP，肠激酶（enterokinase，EK）切割TELKP后，纯化与回收目的毒素蛋白LKP，SDS-PAGE对LKP蛋白予以检测鉴定，高效液相色谱法（HPLC）对其进行纯度检测。采用cellcountingkit-8(CCK-8)、RT-PCR、Westernblot等方法，体外检测毒素蛋白LKP经uPA酶裂解后释放Luffin-β的抗胃癌SGC-7901细胞的活性。　　　结果　　　成功诱导重组载体pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs表达相对分子质量约48.8×103含载体表达标签（Trx）的融合免疫毒素TELKP，EK酶切该蛋白获含290个氨基酸，相对分子质量约31.8×103的目的蛋白LKP。SDS-PAGE检测鉴定表明，LKP蛋白与预期大小一致，其纯度达98.8%。CCK-8、RT-PCR、Westernblot等法检测显示，LKP经uPA酶体外裂解可释放具杀瘤活性的Luffin-β小分子毒素。　　　结论　　　成功克隆到Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因，并将其构建于原核表达载体pET-32a(+)中，且诱导该载体表达了相对分子质量约31.8×103的融合毒素LKP。LKP毒素经uPA酶体外裂解能释放具杀瘤活性的Luffin-β小分子毒素。