上调核糖核酸酶抑制因子对小鼠黑色素瘤B16细胞生长和凋亡的影响

目的研究核糖核酸酶抑制因子（ribonucleaseinhibitor，RI）基因表达对小鼠黑色素瘤B16细胞生长和凋亡的影响。方法构建RI真核表达质粒pIRES2-EGFP-RI稳定转染B16细胞，未转染和空质粒作对照组(pIRES2-EGFP组)，经G418筛选出阳性克隆。RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光检测RI的表达；MTT检测细胞的增殖；流式细胞术、TUNEL及Hochest33342检测细胞周期及凋亡；Westernblot检测凋亡相关的蛋白及ILK/PI3K/AKT信号通路关键分子的表达；分别注射各组B16细胞到C57/BL小鼠建立移植瘤模型，观察肿瘤的生长及肿瘤微血管的变化，进一步分析ILK/PI3K/AKT信号通路蛋白在肿瘤组织中的表达。结果转染RI细胞组的RImRNA和蛋白表达水平显著升高；MTT结果显示B16-RI细胞较对照组增殖能力明显降低，流式细胞结果显示B16-RI细胞的S期明显增加，表明RI表达上调后细胞生长停滞于S期（P<0.05）；Hochest33342、TUNEL及AnnexinV和PI双染色流式法细胞凋亡检测结果证实，B16-RI细胞与对照组相比出现大量凋亡细胞（P<0.01）及典型凋亡形态特征：染色质凝集，核碎裂和明亮的蓝色荧光等；Westernblot结果显示，与对照组相比，B16-RI细胞中ILK、p-Akt、p-GSK3β、Bcl-2及β-catenin的表达明显降低，而活化的Caspase-3和Bax蛋白的表达显著增加（P<0.01）；动物的移植瘤实验结果显示，转RI组的小鼠的瘤重显著降低（P<0.01），瘤组织中的血管密度明显减少，同时ILK、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin在瘤组织中表达减少。TUNEL肿瘤组织凋亡检测结果与体外细胞一致。结论过表达RI可能通过调节ILK/PI3K/AKT信号通路显著抑制了小鼠黑色素瘤B16细胞的生长并诱导了B16细胞的凋亡。