刚地弓形虫HSP70真核表达质粒构建及评价

？目的构建刚地弓形虫热休克蛋白70(TgHSP70)真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK293T细胞内获得表达,为制备基因疫苗奠定基础。方法扩增TgHSP70基因,双酶切后与真核表达质粒p3×Flag-CMW-14连接,经酶切、PCR及测序鉴定;脂质体法将重组体转染HEK293T细胞中,TgHSP70的表达产物通过RT-PCR和westernblot在基因和蛋白2个水平鉴定。结果PCR扩增获得约495bp的HSP70基因片段,p3×Flag-CMW-14-TgHSP70重组质粒构建成功,经双酶切、PCR及测序鉴定,重组质粒基因序列完全正确;将p3×Flag-CMW-14-TgHSP70转染到HEK293T细胞中,经RT-PCR检测获得预期大小目的基因条带,Western-blot检测表达产物大小约19kDa。结论成功构建了真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK293T正确表达。