FGF-2真核表达质粒的构建及对C3H10细胞增殖及成软骨分化的影响

目的：构建成纤维细胞生长因子-2（fibroblastgrowthfactor-2，FGF-2）真核表达质粒，检测其对小鼠间充质干细胞C3H10增殖、成骨及成软骨分化作用的影响。方法：以质粒pAd-Trace-FGF-2为模板，PCR扩增目的基因FGF-2，经BglⅡ、SalⅠ双酶切后连接至pIRES2-EGFP表达载体中获得pIRES2-EGFP-FGF-2真核表达质粒，脂质体转染到C3H10细胞中，另设pIRES2-EGFP空载体转染对照组和空白细胞对照组。RT-PCR及Westernblot法验证各组FGF-2的表达水平，MTT法和流式细胞术检测细胞的增殖活力及细胞周期分布，RT-PCR检测成骨及成软骨、Wnt信号通路相关基因的mRNA水平表达变化，Westernblot法检测Ⅱ型胶原（collagenⅡ，ColⅡ）的表达，甲苯胺蓝染色检测软骨基质的表达。结果：重组表达质粒pIRES2-EGFP-FGF-2经双酶切及测序证实构建正确；质粒转染C3H10细胞后，其FGF-2基因的mRNA和蛋白水平表达较2个对照组明显增高，细胞增殖活力明显增高（P<0.05），软骨相关标志物Ⅰ型胶原（collagenⅠ，ColⅠ）、ColⅡ、蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）mRNA转录水平较2个对照组均明显增高（P<0.05），骨钙蛋白（osteocalcin，OC）、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）mRNA转录水平无明显升高（P＞0.05），Wnt5a及Fzd8mRNA转录水平降低（P<0.05），FGF-2转染组细胞甲苯胺蓝染色呈现紫红色异染。结论：成功构建FGF-2基因重组真核表达质粒，FGF-2过表达可提高C3H10细胞的增殖活力，对C3H10细胞有成软骨效应，但短期成骨效应不明显，可能与下调Wnt5a及受体Fzd8的表达有关。