水稻cDNA文库的构建及巯基蛋白酶抑制剂cDNA的分离

取开花后2周左右的水稻未成熟种子提取总RNA,分离mRNA,进而反转录合成cDNA并定向插入λgt22A克隆载体,经体外包装建成水稻未成熟种子的表达型cDNA文库,经测定库容量达1.5×106Pfu.进一步人工合成水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin)编码基因5＇-端保守的21Nt的寡核苷酸经末端标记作为探针,从2.1×104Pfu中筛选出9个阳性克隆,经鉴定其中8个含有完整的水稻巯基蛋白酶抑制剂编码序列,对1号克隆的序列分析表明,其除含有309bp的水稻巯基蛋白酶抑制剂编码序列外,在5＇-端及3＇-端还分别含有84bp和497bp的非编码序列,其中3＇-端带有AATAAAA两个加尾信号以及31Nt的Poly(A)尾,同水稻巯基蛋白酶抑制剂基因组序列比较,编码区碱基序列完全一致,但5＇-端和3＇-端非编码区有明显差异,其中加尾信号以后的cDNA碱基序列中含有大量的不连续插入.