%0 Journal Article %T 利用CRISPR/Cas9技术构建CTCF蛋白降解细胞系 %A 何超 %A 叶丙雨 %A 师明磊 %A 张彦 %A 张香媛 %A 李平 %A 沈文龙 %A 王天艺 %A 赵志虎 %A 谢德健 %J 遗传 %D 2016 %R 10.16288/j.yczz.16-058 %X 摘要: CTCF是脊椎动物关键的绝缘子蛋白,在细胞生命过程中发挥重要作用,敲除CTCF基因会导致小鼠胚胎死亡。为进一步探讨CTCF的功能,本文利用CRISPR/Cas9介导的同源重组,在内源性CTCF表达框上游敲入一个有丝分裂期降解结构域(Mitosis-special degradation domain, MD),该结构域可以带动CTCF融合蛋白在M期降解。作为对照,将MD结构域的第42位的精氨酸突变为丙氨酸,形成无降解活性的MD*,可使MD*-CTCF融合蛋白始终稳定存在。将嘌呤霉素与融合蛋白同时表达,即可利用抗生素筛选,高效地筛选到纯合克隆。利用蛋白印迹技术和免疫荧光检测3种细胞在不同细胞周期的CTCF蛋白变化情况,发现MD-CTCF细胞系CTCF蛋白含量约为野生型细胞的10%,MD*-CTCF细胞系的CTCF含量与野生型没有显著差别;通过流式细胞术观测降解CTCF对细胞的影响,发现MD-CTCF细胞系G1期明显延长。总之,利用CRISPR/Cas9技术在CTCF表达框上游高效地插入MD,首个CTCF特异性降解的人类细胞系获得成功构建 %K CRISPR/Cas9 %K 基因组编辑 %K CTCF %K 蛋白质稳定性 %K 蛋白降解 %U http://www.chinagene.cn/CN/10.16288/j.yczz.16-058