%0 Journal Article
%T 人ankrd49基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究和rna干扰靶点的鉴定
%A 庞敏
%A 王海龙
%A 郭民
%A 郭睿
%J 中国生物工程杂志
%D 2014
%X 目的:克隆人ankrd49基因并构建其真核表达重组体,利用构建成功的ankrd49真核表达重组体对其进行功能的初步研究,并筛选和鉴定其rna干扰靶点.方法:提取人肺腺癌细胞株a549总rna,逆转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)对ankrd49进行扩增,扩增产物与真核表达载体p3×flag-cmv-14同时进行双酶切,酶切产物连接后转化入感受态细胞top10,阳性重组质粒p3×flag-cmv-14/ankrd49经菌液pcr、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法(lipofectaminetm2000)转染人胚肾细胞(hek293t),免疫印迹(immunoblotting)和免疫荧光技术检测表达产物.免疫荧光法检测ankrd49在宿主细胞内的定位.mtt法检测ankrd49对宿主细胞的增殖作用.设计并合成针对人ankrd49基因的rna干扰靶点序列,与p3×flag-cmv-14/ankrd49共转染hek293t细胞后,immunoblotting鉴定ankrd49的rna干扰靶点.结果:rt-pcr结果显示,从a549细胞中扩增出约720bp的片段.菌液pcr、双酶切及测序结果显示重组质粒p3×flag-cmv-14/ankrd49构建成功且序列正确.免疫荧光和immunoblotting结果显示,在转染p3×flag-cmv-14/ankrd49的细胞中有ankrd49的表达,蛋白质相对分子质量(mr)约为27kda,而转染空质粒组未见表达.mtt结果显示,ankrd49对细胞增殖没有影响.共转染实验结果显示,1号和4号rna干扰序列可以有效降低人ankrd49的表达.结论:成功构建了真核表达重组体p3×flag-cmv-14/ankrd49,该蛋白质位于细胞核,不参与细胞增殖;同时鉴定出该基因的2个有效干扰靶点,为进一步研究其功能奠定了基础.
%K ankrd49
%K 真核表达
%K rna干扰
%K 肺癌
%U http://159.226.100.150:8082/biotech/CN/abstract/abstract16436.shtml