%0 Journal Article
%T htert重组第三代慢病毒载体的构建及其病毒包装鉴定
%A 钟艳平
%A 林若芸
%A 黎丹戎
%A 胡晓霞
%A 王琪
%A 李力
%J 中国生物工程杂志
%D 2011
%X 目的:构建携带人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,htert)基因的慢病毒表达载体及探索高滴度第三代慢病毒包装体系的建立,并观察htert基因在细胞中的表达调控。方法:将htert基因片段插入慢病毒载体pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp中,构建慢病毒表达质粒pcdh-htert。通过酶切、dna测序验证htert片段的准确性后,将pcdh-htert、pcdh-pack-gag、pcdh-pack-rev和vsv-g共转染包装细胞293t,浓缩上清并测定病毒滴度获得重组慢病毒,并通过pcr及293t中htert蛋白的表达鉴定重组慢病毒。将重组慢病毒感染靶细胞,通过检测标记蛋白-绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,gfp)、htert蛋白表达和端粒酶活性进一步验证pcdh-htert在细胞中表达。结果:pcdh-htert携带正确htert基因,将其与包装质粒共转染293t细胞能产生重组病毒;病毒基因组pcr证实htert基因插入,感染293t后可检测到htert蛋白的表达;目的基因htert能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞并稳定表达,荧光显微镜下可直接观察gfp;rt-pcr、westernblot及trap-pcr-elisa法检测感染后的细胞,发现htertmrna、htert蛋白的表达及端粒酶活性明显增强。结论:成功构建了第三代慢病毒表达载体pcdh-htert,并获得高效的重组慢病毒,能将外源htert基因导入靶细胞重建端粒酶活性,为构建永生化细胞系奠定基础。
%K 人端粒酶逆转录酶
%K 慢病毒载体
%K 病毒包装
%K 绿色荧光蛋白
%U http://159.226.100.150:8082/biotech/CN/abstract/abstract15602.shtml