%0 Journal Article
%T 果蝇吡咯啉-5-羧酸还原酶的表达、纯化及理化特点
%A 冯昌增
%A 谢月辉
%A 曹毅
%A 孟照辉
%J 中国生物工程杂志
%D 2012
%X 吡咯啉-5-羧酸还原酶(p5crs)是普遍存在于原核和真核生物中的一种重要管家蛋白,其主要的功能是催化吡咯啉-5-羧酸(p5c)转化为脯氨酸,同时将nad(p)h氧化为nad(p)+。为揭示果蝇p5cr的聚合形式、酶学性质及晶体结构,提取了果蝇的总rna,通过逆转录获得了cdna,进而通过pcr获得了编码果蝇p5cr的cdna片段;将此片段连接到pet-28a(+)载体上,在大肠杆菌(escherichiacoli)中得到了高效表达,依次经过硫酸铵分级沉淀、亲和层析及凝胶过滤层析得到了适合晶体生长的高纯度蛋白;通过egs交联实验和凝胶过滤层析检测了p5cr在溶液中的聚合形式;应用分光光度法测定了果蝇p5cr的酶活性参数;采用悬滴气相扩散法筛选了p5cr的结晶条件并进行了优化。实验结果:(1)纯化后的蛋白样品经sds-page检测,结果显示,凝胶上已基本观察不到杂蛋白质条带,说明目的蛋白质纯度较高;(2)果蝇p5cr在溶液中的基本存在形式是十聚体,在此基础上可形成更大的聚合形式;(3)果蝇p5cr参与抗癌药物硫代脯氨酸的代谢,在该逆向反应中最适ph为高碱性,该酶在45℃的半衰期约15分钟;(4)筛选得到了果蝇p5cr的初步结晶条件(0.2mol/lammoniumphosphatedibasic,20%peg3350ph8.0)。
%K 果蝇
%K 吡咯啉-5-羧酸还原酶
%K 同源多聚体
%K 结晶
%U http://159.226.100.150:8082/biotech/CN/abstract/abstract15787.shtml