%0 Journal Article
%T 抗vegf单克隆抗体fab片段在e.coli中的分泌表达
%A 王志龙
%A 王英明
%A 刘峥兆
%A 卢大儒
%A 朱化星
%J 中国生物工程杂志
%D 2014
%X 目的：在大肠杆菌中构建、表达和纯化抗血管内皮生长因子（vegf）的fab片段（兰尼单抗，ranibizumab），通过发酵条件的控制实现其在大肠杆菌周质和胞外的高效分泌表达，并检测其抗vegf的活性。方法：以pet30a为质粒载体，构建了fd链和l链前都含有ompa信号肽、sd序列和t7promoter的克隆载体pet30a（+）-lc-hc，转化bl21（de3）表达菌株，并进行了培养基、温度和iptg诱导浓度的条件优化。结果：确定fab片段在大肠杆菌分泌表达摇瓶发酵最佳条件为：在含有1.5%tryptone，1%yeastextract，0.5%glucose，0.15%nacl，0.1%nh4cl，0.08%mgcl2·6h2o的1l培养基的摇瓶中，按照10%的接种量，37℃摇床培养至对数生长后期（od600为2左右），添加0.1mmol/liptg诱导剂，于16℃条件下诱导表达过夜（16h左右）。用周质破菌提取分泌至大肠杆菌周质腔的fab片段，同时用中空纤维柱浓缩发酵培养基，最后用proteing亲和层析柱一步纯化洗脱，经sds-page检测分析和brandford法测蛋白浓度得出纯化的fab抗体片段纯度在90%以上，分泌表达纯化量为0.4mg/l。以vegf165作为结合抗原，间接elisa分析纯化后的fab抗体ec50=30ng/ml。继续用该培养基在3.7l体积发酵罐中进行2l体积的发酵，获得最终的菌体产率为30g/l，可亲和纯化fab抗体量为1.94mg/l。结论：成功实现了fab抗体片段在大肠杆菌中的高效分泌表达，且具有很高的活性，为规模化制备fab抗体片段提供了研究依据。
%K 抗vegf
%K fab抗体片段
%K 大肠杆菌
%K 分泌表达
%U http://159.226.100.150:8082/biotech/CN/abstract/abstract16384.shtml