%0 Journal Article
%T fl-fen-1-细胞的建立
%A 石斌山　余应年
%J 癌变·畸变·突变
%D 1999
%X ？目的:fen-1是一种结构特异性核酸酶,它识别特定的核酸分叉结构,并切除含有游离5’末端的单链核酸。fen-1有对dna复制和修复都必需的双重功能。目前有关fen-1在高等动物和人类中的系统研究尚无报道。本实验采用反义核酸技术,得到fen-1基因表达被阻断的哺乳动物细胞fl-fen-1-,为进一步在哺乳动物细胞水平上研究fen-1基因在dna复制和修复过程中的作用提供基础。方法:11hfen-1反义表达质粒的构建　fen-1表达质粒hpet-fch经ncoⅰ和bamhⅰ双酶切,得到1084bp的hfen-1片段,经klenow补平后两端接上salⅰ连接头,作为连接反应的外源片段。表达载体采用经改建的哺乳动物表达载体pmamneoamp2,以salⅰ酶切,并用cip脱磷酸化,将外源片段和载体片段以t4连接酶连接过夜,转化感受态dh5α酶切,酶切筛选转化子,得到hfen-1反义表达质粒pmamneoampfnb2。21细胞转染及筛选　细胞的转染采用改进的磷酸钙介导的细胞转染法,将mamneoamp2fmb2和pmamneoamp2质粒分别导入fl细胞,用含400μg/mlg418的mem完全培养基筛选,分别得到fl-fen-和fl-m细胞。然后在含200μg/mlg418的mem完全培养基维持培养。31细胞生长曲线的测定　将fl、fl-m和fl-fen-细胞按5×104/ml接种于24孔培养板,培养基均含有10μmol/l地塞米松,另设一组fl-fen-细胞不加地塞米松。每组细胞每天各取3个复孔,用细胞计数板进行计数,共计数8天。以第2天和第6天为对数生长期,计算细胞倍增时间。结果:fl、fl-m和fl-fen-1-的生长曲线没有明显差异,其细胞倍增时间td分别为2.11天、2.23天和2.23天。而fl-fen-1在10μmol/l地塞米松的诱导下,细胞生长速度明显下降,细胞倍增时间td为3.09天。进一步分析同时处理的fl-fen-1-细胞和经地塞米松诱导的fl-fen-1-细胞,发现经培养第5天两者出现显著差异(p<0.05),第6天以后,表现为极显著差异(p<0.01)。结论:fl-fen-1-细胞在地塞米松的诱导下生长出现了明显的抑制,细胞倍增时间td为对照组的近1.5倍。细胞生长曲线的测定发现fl-fen-(dex.)细胞的生长速度在第5天开始下降,此后持续受到抑制,最后导致部分细胞死亡。这说明在哺乳动物细胞中fen-1基因在细胞繁殖和dna复制的过程中起着重要作用,fen-1基因的被阻断导致了细胞生长的抑制。
%U http://www.egh.net.cn/CN/abstract/abstract1327.shtml