%0 Journal Article
%T 结核分枝杆菌输出重复蛋白(erp)8基序突变体的构建及表达分析
%A 马佳丽
%A 王晶
%A 郝秀静
%A 赵东
%A 李勇
%A 张斯民
%A 孙毅
%A 李敏
%J 农业生物技术学报
%P 1009-1017
%D 2012
%X ？结核病(tb)是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)引起的古老疾病，与艾滋病、疟疾一并成为当今世界威胁人类健康的三大传染病。输出重复蛋白(erp)是结核分枝杆菌的一种重要毒力因子，在临床上具有一定的潜在应用价值。为了深入研究erp的功能，本研究采用固相亚磷酰胺三酯化学方法合成包含8个pglts基序的基因dom8，并利用重叠延伸pcr的方法将该片段与domc(长度为520~855bp)连接，经基因组装得到erp蛋白8基序突变片段。进一步对获得的8基序全长基因进行c端、n端及cn两端缺失突变体，将其构建至原核表达载体pet-28a(+)上，将经酶切、pcr、测序鉴定的阳性质粒转化入大肠杆菌(escherichiacoli)bl21(de3)plyss菌株中。利用tricine/sds-page、westernblot检测结核分枝杆菌erp重组蛋白的表达情况。结果显示，通过重叠延伸pcr法成功扩增了erp基因pglts8基序全长及8基序c-端、n-端和cn-端缺失突变体并构建至原核表达载体，经iptg诱导后,用tricine/sds-page得到大小分别约为13.0、17.1和6.7kd的目的蛋白。制备弗氏佐剂疫苗免疫试验兔，elisa测定抗体效价，血清效价达到1∶512倍时，即可心脏采血分离，制备抗血清，并对提取的蛋白进行westernblot检测，结果表明，一抗为l∶200倍稀释的兔阳性血清，二抗为1∶800倍稀释的hrp标记的羊抗兔igg-hrp；westernblot检测erpmutc8、mutn8和mutcn8，结果显示，仅目的蛋白erpmutc8和mutn8能被结核分枝杆菌erp抗血清识别，表明，bl21(de3)plyss(pet28a-c8)和bl21(de3)plyss(pet28a-n8)所表达目的蛋白表达特异，可以被结核分枝杆菌erp抗血清识别，具有良好的抗原性。研究结果为深入研究erp的功能，制备结核病的诊断抗原和基因工程重组疫苗提供基础资料
%K 结核分枝杆菌
%K 输出重复蛋白(erp)
%K 重叠延伸pcr
%K 原核表达
%U http://www.jabiotech.org.cn/CN/abstract/abstract9828.shtml