%0 Journal Article
%T p38MAPK基因RNAi慢病毒载体的构建及在MC3T3-E1细胞的表达
%A 冯正平
%A 邓华聪
%A 姜蓉
%A 杜佳
%A 陈丹燕
%A 梁小燕
%J 第三军医大学学报
%P 1598-1601
%D 2010
%X 目的构建小鼠p38MAPK基因RNAi慢病毒载体，观察其对MC3T3-E1成骨细胞p38MAPK表达及细胞凋亡的影响。方法设计并合成3对互补的针对小鼠p38MAPKmRNA的oligoDNA片段，退火形成双链DNA，与经HpaⅠ酶切后的载体连接，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。重组质粒与慢病毒包装载体共转染293T细胞，包装产生慢病毒，流式细胞仪检测病毒滴度，p38MAPK-shRNA慢病毒载体转染体外培养MC3T3-E1细胞，荧光定量PCR检测MC3T3-E1细胞p38MAPKmRNA表达，进行p38MAPK干扰有效靶点的筛选。22.2mol/L葡萄糖刺激培养MC3T3-E1细胞7d，Westernblot检测MC3T3-E1细胞p38MAPK蛋白的表达，流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡。结果酶切和测序均证实各重组质粒核苷酸序列插入正确，所得质粒分别命名为p38MAPK-shRNA1、p38MAPK-shRNA2、p38MAPK-shRNA3，流式细胞仪测定病毒滴度分别为2.4×108、2.8×108、2.5×108TU/ml。p38MAPK-shRNA转染MC3T3-E1细胞效率达到74%以上，RT-PCR检测结果显示，各p38MAPK-shRNA转染组MC3T3-E1细胞p38MAPKmRNA表达较正常对照组分别下降了78.8%、84.3%和60.2%（P<0.01），其中以p38MAPK-shRNA2的干扰效率最高。Westernblot检测结果显示，与正常对照组相比，高糖组、空载体转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达明显增加（P<0.01）。p38MAPK-shRNA慢病毒转染组MC3T3-E1细胞p-p38MAPK蛋白表达水平较高糖组明显下调（P<0.01）。流式细胞仪检测结果显示，与正常对照组相比，高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率显著增加（P<0.01）；p38MAPK-shRNA慢病毒转染组以及p38MAPK信号转导阻断剂组较高糖组MC3T3-E1细胞凋亡率明显减少（P<0.05，P<0.01）。结论成功构建了靶向p38MAPK基因RNAi慢病毒载体，其能有效抑制MC3T3-E1细胞p38MAPK基因表达，减少高糖诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。
%K pMAPK
%K 成骨细胞
%K RNA干扰
%K 慢病毒属
%U http://aammt.tmmu.edu.cn/oa/darticle.aspx?type=view&id=201001119