%0 Journal Article
%T 肺炎链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH与热休克蛋白DnaJ的相互作用
%A 马峰
%A 王建敏
%A 王丽滨
%A 宋志新
%A 徐红梅
%A 邢燕
%A 粟玉凤
%A 张雪梅
%A 孟江萍
%J 第三军医大学学报
%P 1629-1635
%D 2015
%X 目的验证肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae,S.pn）糖酵解关键酶三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)和热休克蛋白DnaJ的相互作用。方法PCR扩增S.pnD39GAPDH蛋白编码基因gap全长，将其克隆至pET-28a(+)，重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导GAPDH-6His的表达，经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，用SDS-PAGE鉴定其纯度。重组GAPDH蛋白经腹部皮下免疫昆明小鼠获得多克隆抗体。Westernblot鉴定GAPDH的保守性。采用大肠杆菌双杂交系统、直接结合实验、生物膜层干涉技术(Bio-layerInterferometry,BLI)验证GAPDH和DnaJ的相互作用。结果获得了纯度达90%的GAPDH重组蛋白，并获得了效价达107的抗GAPDH多克隆抗体，Westernblot检测显示在7株不同血清型S.pn的全菌裂解液和培养上清中均存在和抗GAPDH抗体反应的特异性条带。大肠杆菌双杂交系统显示GAPDH和DnaJ共转化菌株能够在3-AT平板及双选择培养平板上生长，提示二者在细菌胞内有相互作用。直接结合实验和BLI显示随着加入GAPDH蛋白浓度的增加，二者的结合量也增加，提示GAPDH和DnaJ的结合具有浓度依赖性。BLI实验也显示GAPDH和DnaJ的亲和常数为1.12×10-7mol/L。结论糖酵解关键酶GAPDH在肺炎链球菌中保守表达，且为分泌性蛋白；该蛋白和热休克蛋白DnaJ在细胞内存在相互作用，且为直接相互作用。
%K 肺炎链球菌
%K 三磷酸甘油醛脱氢酶
%K 热休克蛋白DnaJ
%K 蛋白相互作用
%U http://aammt.tmmu.edu.cn/oa/darticle.aspx?type=view&id=201411153