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pk-15细胞微载体悬浮培养生产猪细小病毒的工艺研究
李智力,易小萍,储炬,庄英萍,张嗣良
中国生物工程杂志 , 2015,
Abstract: 通过对猪细小病毒接毒时间toi、moi和收毒时间进行优化,开发了一种基于pk-15细胞静置培养的猪细小病毒生产工艺,最大病毒滴度达到107.5tcid50/ml。通过进一步优化接毒时间,成功建立了基于pk-15细胞反应器微载体悬浮培养的猪细小病毒培养工艺,在5l反应器上最大病毒滴度达到107.2tcid50/ml。首次发现乳酸对葡萄糖得率与病毒滴度的正相关性,当猪细小病毒滴度处于最大值时,乳酸对葡萄糖得率也达到最大值,可作为指针病毒滴度及收毒时间的重要参数。
三种益生菌菌株与PK-15细胞共培养抗TGEV作用 Anti- TGEV effect of three probiotics strains and PK- 15 cells coculture
魏萍,刘文娜,王辉辉
- , 2016,
Abstract: 为模拟猪肠道内环境,探究益生菌与细胞共培养抗TGEV作用,利用Transwell小室在体外建立益生菌与PK-15细胞共培养,通过台盼蓝染色,检测PK-15细胞存活率。结果表明,当益生菌菌体浓度102cfu·m L-1≤c≤1012cfu·m L-1,共培养时间为1和3 h;当共培养时间1 h≤t≤24 h,益生菌菌体浓度为102、104、106和108cfu·m L-1时,PK-15细胞存活率较高,益生菌与PK-15细胞共培养成立。采用MTT比色法检测对TGEV抑制率,结果显示,益生菌菌体浓度约为102~108cfu·m L-1,共培养时间为1~24 h时对TGEV抑制率均达90%以上。此外,益生菌与PK-15细胞共培养的TGEV平均滴度较低。
Replicative kinetics of classical swine fever virus in PK-15 cells
通过基因组定量研究猪瘟病毒在细胞中的增殖特性

XU Xing-ran,GUO Huan-cheng,SHI Zi-xue,XIA Xian-zhu,TU Chang-chun,
徐兴然
,郭焕成,史子学,夏咸柱,涂长春

微生物学报 , 2007,
Abstract: 应用间接免疫荧光、Real-time PCR和病毒感染滴度(TCID50)测定技术,分别从病毒抗原、病毒基因组RNA复制水平和病毒感染滴度变化3个方面,研究了猪瘟病毒(CSFV)在PK-15细胞中增殖的特点,用猪瘟病毒石门株感染96孔板培养的细胞,1×102个TCID50/孔,间接免疫荧光检测结果显示感染后8h能检测到被荧光抗体染色的感染细胞,随感染时间的延长,出现荧光的细胞数量逐渐增多,在感染后72h,几乎所有细胞均能出现荧光。Real-time PCR结果显示在细胞感染初期的8~24h,病毒的基因组RNA复制呈加速趋势,其拷贝数在感染后72h达到高峰。此外,在感染后8h能检测到病毒基因组负链RNA转录,不过负链RNA在病毒增殖过程中维持在较低的水平。TCID50测定结果表明CSFV的感染滴度增加趋势与基因组类似,在病毒感染8h后能检测到具有感染性的子代病毒,感染滴度在8~20h之间逐渐增长,24~48h之间增长速度稍减慢,在感染后48~52h达到高峰,能在72h之内维持较高的感染滴度。
MOI对PK-15细胞感染PPV后细胞因子mRNA转录时相的影响
李厚伟,徐进,吴红云,李建正
微生物学通报 , 2012,
Abstract: 【目的】更好地了解感染复数(MOI)对猪细小病毒(PPV)感染PK-15细胞后引起细胞因子的反应,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】运用荧光定量PCR技术,测定和分析3种感染复数对PPV感染PK-15细胞引起的病毒DNA量的变化和细胞因子IFN-、IRF-3、TNF-a和IL-18分泌水平。【结果】PPV感染PK-15细胞12 h病毒开始大量迅速增殖,感染48 h且MOI为1.0时达到最高峰;PPV感染后可引起PK-15细胞中IFN-、IRF-3、TNF-a和IL-18的表达量显著增加,其中IRF-3基因在感染后1 h且MOI为10.0时表达量达到967倍。【结论】细胞因子的分泌水平显著依赖感染复数和感染时间的交互作用。
猪细小病毒感染pk-15细胞抗病毒相关因子转录变化的分析
李厚伟,魏战勇,尹海燕,陈红英,李金磊,韩志涛,崔保安
牲畜兽医学报 , 2011,
Abstract: ?为了解猪细小病毒(ppv)感染后引起干扰素及其相关细胞因子的反应,探讨宿主—病毒之间的作用关系,作者运用荧光定量pcr技术,测定和分析ppv感染pk-15细胞引起的病毒dna量的变化和细胞因子ifn-β、ifn-γ、ifnar-1、ifnar-2、mhc-ⅰ、mhc-ⅱ、mx1、inos、2-5as、rnasel和irf-3的转录水平。结果显示,ppv感染pk-15细胞12h病毒开始大量迅速增殖,48h达到最高峰;ppv感染后可引起pk-15细胞中ifn-β、ifn-γ、ifnar-1、ifnar-2、mhc-ⅰ、mhc-ⅱ、mx1、inos、2-5as、rnasel和irf-3的转录量显著增加,其中mx1基因在24h转录量达到8423倍。猪细小病毒感染可引起pk15细胞抗病毒相关因子转录增加。
pcv-2感染对pk-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响
韩志涛?,李金磊?,陈红英?
西北农林科技大学学报(自然科学版) , 2011,
Abstract: 【目的】了解猪圆环病毒2型(pcv-2)感染对pk-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】运用荧光定量pcr技术,测定和分析pcv-2感染pk-15细胞后0(未接种病毒),1,6,12,24,48,72h时病毒dna含量及细胞因子ifn-β、ifn-γ、ifnar-1、ifnar-2、mhc-ⅰ、mhc-ⅱ、mx1、nos、rnasel和irf-3mrna转录水平的变化。【结果】pcv-2感染pk-15后1h就可以检测到病毒dna,在感染后24h病毒开始大量迅速增殖,于感染72h时达到最高峰。与0h相比,pcv-2感染后ifn-β、irf-3的表达量在感染12h时显著增加,其他时间表达量下降;ifn-γ、mhc-ⅱ的表达量在感染12h时增加不明显,其他时间表达量下降;感染pcv-2后ifnar-2、mhc-ⅰ、mx1的表达量下降;rnasel的表达量在感染12h时显著减少,其他时间表达量增加,48h时表达量增加显著;ifnar-1的表达量在感染72h时显著增加,其他时间表达量下降;未检测出nos的表达。【结论】随着pcv-2病毒含量的增加,以上几种主要抗病毒因子的表达量不明显或有所下降,表明pcv-2感染pk-15细胞后可逃避机体的抗病毒作用机制。
ppv感染pk-15细胞后对4种抗病毒细胞因子mrna转录时相的影响
耿静微?,李厚伟?,尹海燕?
西北农林科技大学学报(自然科学版) , 2011,
Abstract: 【目的】了解猪细小病毒(ppv)感染对抗病毒相关细胞因子mrna转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】对ppv感染pk-15细胞的病变进行了显微观察,运用荧光定量pcr技术,测定和分析ppv感染pk-15细胞后,细胞病毒dna含量及巨噬细胞炎症蛋白1α(mip-1α)、转化生长因子β1(tgf-β1)、磷酸甘油酸激酶1(pgk1)和murr1等细胞因子mrna相对表达量的变化。【结果】ppv可以快速诱导pk-15细胞产生细胞病变。感染后1h即可检测到ppvdna,随着时间的延长,ppvdna含量逐渐增加,并于48h时达到峰值,相对含量为1800左右。mip-1α和pgk1mrna的相对表达量在感染后2h显著增加,之后下降;tgf-β1mrna的相对表达量在72h时显著增加;murr1mrna的相对表达量在24h时显著增加,48h后下降。【结论】ppv感染可引起pk-15细胞抗病毒因子mrna表达水平升高。
一株新的类猪圆环病毒因子的核苷酸全序列和 体外感染性
温立斌,何孔旺,杨汉春,倪艳秀,张雪寒,郭容利,潘群兴
中国科学 生命科学 , 2008,
Abstract: 在中国猪血清中分离到一新因子,命名为P2.P2为闭合环状基因组,全长993个核苷酸.序列分析表明其与猪圆环病毒密切相关.随后对构建的P2因子分子克隆的体外感染性进行了研究.结果表明,在转染PK-15细胞后,只有P2因子的双拷贝串联分子克隆具有感染性,表现为可在细胞的胞浆和胞核中形成包涵体,胞浆包涵体为圆形或不规则形,直径0.1~0.4μm;胞核包涵体有两种类型,一种为小而圆、直径约0.1μm的包涵体,另一种为大而呈六角性的包涵体,直径约为0.5~1.4μm胞浆包涵体和胞核包涵体都没有外膜,相比较而言,后者有更高的电子密度.将转染后的细胞连续传代,对第5代细胞培养物抽提DNA,进行PCR,结果也只有在转染P2因子双拷贝串联分子克隆的细胞培养物中检测到P2的DNA.而转染空载体、P2因子单分子克隆和未转染的PK-15细胞微观结构未见变化,在第5代细胞培养物中也未能检测到P2的DNA.同样,只有在转染P2因子双拷贝串联分子克隆的细胞和随后传代的细胞中能检测到P2抗原.这是首次报道如此小基因组的类猪圆环病毒P2的全序列和其在体外具有感染性.
一株新的类猪圆环病毒因子的核苷酸全序列和体外感染性
温立斌, 何孔旺, 杨汉春, 倪艳秀, 张雪寒, 郭容利, 潘群兴
中国科学 生命科学 , 2008,
Abstract: 在中国猪血清中分离到一新因子,命名为P2.P2为闭合环状基因组,全长993个核苷酸.序列分析表明其与猪圆环病毒密切相关.随后对构建的P2因子分子克隆的体外感染性进行了研究.结果表明,在转染PK-15细胞后,只有P2因子的双拷贝串联分子克隆具有感染性,表现为可在细胞的胞浆和胞核中形成包涵体,胞浆包涵体为圆形或不规则形,直径0.1~0.4μm;胞核包涵体有两种类型,一种为小而圆、直径约0.1μm的包涵体,另一种为大而呈六角性的包涵体,直径约为0.5~1.4μm.胞浆包涵体和胞核包涵体都没有外膜,相比较而言,后者有更高的电子密度.将转染后的细胞连续传代,对第5代细胞培养物抽提DNA,进行PCR,结果也只有在转染P2因子双拷贝串联分子克隆的细胞培养物中检测到P2的DNA.而转染空载体、P2因子单分子克隆和未转染的PK-15细胞微观结构未见变化,在第5代细胞培养物中也未能检测到P2的DNA.同样,只有在转染P2因子双拷贝串联分子克隆的细胞和随后传代的细胞中能检测到P2抗原.这是首次报道如此小基因组的类猪圆环病毒P2的全序列和其在体外具有感染性.
载体介导的shrna抑制猪瘟病毒在pk-15细胞中增殖特性的研究
冶贵生,张彦明,徐浩
牲畜兽医学报 , 2007,
Abstract: ?利用生物学软件分析猪瘟病毒基因组ns3基因,设计针对ns3基因不同位置的干扰序列,化学合成这些序列,然后退火连接为双链干扰片段,再定向克隆到干扰载体中,将酶切和序列测定鉴定正确的重组载体命名为pgene-ns3-1、pgene-ns3-2、pgene-ns3-3、pgene-ns3-negative。重组干扰载体经纯化后转染pk-15细胞,并进行g418抗性筛选。克隆细胞扩大培养后,接种猪瘟病毒shimen株,收集细胞的分别进行实时定量pcr和elisa光吸收度分析。real-timepcr分析表明:pgene-ns3-1、pgene-ns3-2、pgene-ns3-3转录产生的shrna分子与对照细胞比较,均在一定程度上沉默了病毒的mrna,抑制率约为63%、46%、49%。elisa检测结果表明:转染pgene-ns3-1、pgene-ns3-2、pgene-ns3-3重组载体的pk-15细胞均在不同程度上抑制了猪瘟病毒粒子的增殖。
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