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e1a激活基因阻遏子基因表达变化与颈动脉血管重塑的关系
李洋?,,田孝祥?,彭程飞?,韩雅玲?
生物化学与生物物理进展 , 2015,
Abstract: e1a激活基因阻遏子(creg)是一种广泛表达的小分子糖蛋白,但其生物学功能仍不完全清楚.为了探索病理性血管重塑的病理生理机制以及creg在其中发挥的调控作用,采用颈动脉导丝损伤模型构建小鼠病理性血管重塑模型,应用小动物超声、masson染色、免疫组织化学染色、rt-pcr、western-blot等方法检测小鼠颈动脉内膜-中膜厚度、胶原含量、ⅰ型胶原和creg表达变化.结果表明,小鼠颈动脉损伤后3d血管壁cregmrna和蛋白质水平迅速下降,损伤后7dcreg表达回升,至损伤后14d和28d基本恢复到正常对照组水平.血管损伤后3d血管壁中ⅰ型胶原mrna水平开始升高,损伤后7d血管壁开始增厚,管壁中ⅰ型胶原表达水平继续增高,损伤后14d和28d新生内膜形成,管腔严重狭窄,ⅰ型胶原在管壁和新生内膜内大量表达.血管损伤早期creg表达水平的变化与病理性血管重塑程度呈负相关关系,creg的表达为先迅速降低,再逐渐回升,而胶原表达和血管重塑程度则表现为持续加重.上述研究结果提示,creg基因表达参与血管损伤导致的病理性血管重塑过程,并可能决定了血管重塑的进程和结局.
胚胎干细胞sm22α-egfp表达克隆的建立及平滑肌细胞体外发育的动态观察
韩雅玲?,徐 凯?,康 建?,,田孝祥?,李少华?
生物化学与生物物理进展 , 2006,
Abstract: 为探讨血管发育早期血管平滑肌细胞(vsmcs)募集和增殖特点,构建了含有sm22α启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(egfp)编码序列的质粒,建立了平滑肌特异性蛋白sm22α启动子控制下稳定表达egfp的胚胎干细胞株(escs),以研究vsmcs的发育特点.实验发现,起源于sm22α-egfpescs形成的胚胎小体(ebs)在第11天开启sm22α启动子并表达egfp.此后egfp阳性细胞持续增加,在第30天达到高峰.vsmcs多起源于ebs中细胞密集处,应用免疫荧光染色及rt-pcr观察到egfp阳性细胞表达多种平滑肌特异性标志物.在贴壁培养的胚胎小体中vsmcs形态可分为纺锤形及上皮样的多角形,慢速视频显微摄像测得纺锤形细胞迁移速度较上皮形细胞快.以上结果表明,sm22α-egfpescs分化形成的ebs可以模拟体内早期胚胎血管形成过程,从形态学上获得vsmcs募集分化的证据.
rhoa和血清反应因子(srf)介导e1a激活基因阻遏子诱导人血管平滑肌细胞分化
韩雅玲?,徐红梅?,,胡 叶?,康 建?,刘海伟?
生物化学与生物物理进展 , 2006,
Abstract: 为探讨e1a激活基因阻遏子(creg)对人血管平滑肌细胞(vsmcs)分化的调控机制,应用重组逆转录病毒表达载体plncx2(+)/creg及plxsn(-)/creg制备稳定感染hitasy细胞模型,观察creg蛋白过表达及表达抑制对人vsmcs分化的影响并探讨其调控机制.结果显示:plncx2(+)/creg稳定感染细胞呈分化表型,细胞细长变成组织样聚集生长趋势,细胞中creg蛋白和平滑肌分化标志蛋白平滑肌α-肌动蛋白(smα-actin)表达显著增加,同时smα-actin相关调控因子———血清反应因子(srf)入核转位,rhoa总蛋白表达上调,以rho激酶特异性抑制剂y-27632作用后,creg诱导的smα-actin表达下调的同时srf出核转位;plxsn(-)/creg稳定感染的细胞体积变大,细胞极性消失,呈无序生长,细胞中creg和smα-actin蛋白表达显著降低,同时伴有srf出核转位及rhoa总蛋白表达下调.免疫共沉淀分析发现,creg蛋白能被分泌到vsmcs培养基中表达,并可与细胞膜受体6-磷酸甘露糖/胰岛素样生长因子ⅱ型受体(m6p/igf2r)发生直接相互作用.用蛋白磷酸酶pp2a特异性抑制剂okadaicacid减少m6p/igf2r在细胞膜表面分布,可明显抑制creg过表达引起的rhoa、srf和smα-actin表达.上述结果提示,在体外培养的人vsmcs中,creg可能作为一种分泌型蛋白质通过与细胞膜受体m6p/igf2r相互作用,依次激活smα-actin蛋白相关调控因子rhoa和srf引起smα-actin表达增加,促进vsmcs向分化表型转换.
e1a激活基因阻遏子促进人血管平滑肌细胞分化和迁移
韩雅玲?,胡 叶?,刘海伟?,康 建?,,李少华?
生物化学与生物物理进展 , 2005,
Abstract: 为探讨e1a激活基因阻遏子(cellularrepressorofe1a-stimulatedgenes,creg)蛋白在人血管平滑肌细胞株hitasy分化和迁移中的调控作用,构建了重组逆转录病毒载体plncx2(+)/creg和plxsn(-)/creg.以带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,gfp)的空载体plncx(+)/gfp和正常hitasy为对照,用磷酸钙共沉淀法将重组逆转录病毒载体转染293细胞,包装出完整的逆转录病毒后,感染hitasy.经g418筛选,获得稳定感染的细胞克隆.应用免疫荧光染色、蛋白质印迹等方法检测creg和平滑肌分化标志蛋白α-肌动蛋白(smα-actin)表达,同时通过刮伤实验、慢速显微摄像技术检测细胞迁移能力以及用明胶酶谱方法分析细胞基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,mmps)的活性.结果表明:plncx2(+)/creg稳定感染的hitasy中creg和smα-actin蛋白表达上调,mmp-2和mmp-9活性升高,细胞迁移速度加快;plxsn(-)/creg稳定感染的hitasy中creg和smα-actin蛋白表达下调,mmp-2和mmp-9活性降低,细胞迁移速度减慢.上述研究提示creg在诱导血管平滑肌细胞分化的同时促进细胞迁移.
PON1基因rs854572单核苷酸多态性与氯吡格雷抵抗的相关性研究
刘滕飞,张效林,蔡文芝,,梁振洋,孙莹,韩雅玲
解放军医学杂志 , 2012,
Abstract: [摘要] 目的 探讨对氧磷酶1(PON1)基因rs854572单核苷酸多态性与氯吡格雷抵抗(CR)发生的相关性。方法 采用病例-对照研究的方法,共入选850例沈阳军区总医院冠心病住院患者,采用光学比浊法测定20μmol/L二磷酸腺苷(ADP)诱导的残余血小板聚集率(RPA),当RPA≥70%时,即定义为CR。将入选患者分为CR组(n=215)和非氯吡格雷抵抗(NCR)组(n=635),采用焦磷酸测序法测定PON1基因rs854572单核苷酸多态性的基因型及等位基因分布频率。结果 PON1基因rs854572多态位点在两组间基因型分布频率皆符合Hardy-Weinberg平衡定律,三种基因型(CC、CG和GG)分布频率在CR组和NCR组分别为23.7%、49.3%、27.0%和24.1%、50.2%、25.7%,三种基因型在两组间分布频率差异无统计学意义(P=0.93)。C、G等位基因分布频率在两组间差异亦无统计学意义(P=0.763)。Logistic回归校正性别、年龄、体重指数、吸烟、高血压、高脂血症及糖尿病等冠心病易患因素后,PON1基因rs854572单核苷酸多态性仍与冠心病患者CR的发生无相关关系。结论 PON1基因单核苷酸多态位点rs854572与冠心病患者CR的发生无关。
血管紧张素(1-7)在高盐高脂饮食诱导的代谢综合征小鼠肾脏损伤中的作用
朱男,韩雅玲,,张效林,赵昕,张玉婕,李洋
解放军医学杂志 , 2013,
Abstract: 目的 采用高盐高脂饮食喂养C57BL/6小鼠建立代谢综合征(MS)模型,探讨血管紧张素转换酶2(ACE2)及血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]在MS导致的肾脏损伤中的作用。方法 56只SPF级C57BL/6小鼠随机分为7组(每组8只),分别给予正常饮食(ND),高盐(HSD)饮食,高脂(HFD)饮食,高盐高脂(HSFD)饮食,以及分别采用依那普利20mg/(kg·d)+高盐高脂饮食(HSFD-E),缬沙坦50mg/(kg·d)+高盐高脂饮食(HSFD-V),缬沙坦50mg/(kg·d)+Ang(1-7)Mas受体抑制剂A-779150ng/(kg·d)+高盐高脂饮食(HSFD-VA)。16周后检测血压、体重、血糖及尿蛋白排泄率等基础代谢指标,然后颈动脉取血,ELISA法检测血清中AngⅡ及Ang(1-7)水平,Westernblotting检测肾脏中ACE2及Ⅲ型胶原的表达,HE及Masson染色观察肾脏病理学改变。结果 高盐高脂饮食喂养16周后,C57BL/6小鼠血压、内脏脂肪重量与体重比、血脂、血糖以及尿蛋白排泄率等各项代谢指标均明显升高(P<0.05);肾脏出现明显纤维化改变;血清AngⅡ水平升高,Ang(1-7)水平降低(P<0.01);肾脏组织中ACE2表达降低(P<0.05)。给予缬沙坦干预可明显缓解高盐高脂引起的代谢异常,肾脏损伤程度减轻,肾脏和血清中ACE2及Ang(1-7)表达增加(P<0.05)。给予依那普利或缬沙坦+A-779干预后上述指标与未干预组比较均无明显变化。结论 应用高盐高脂饮食喂养C57BL/6小鼠可成功建立MS模型。AngⅡ受体1阻滞剂缬沙坦能够缓解高盐高脂导致的代谢异常和肾脏损伤,其对肾脏的保护机制可能与Ang(1-7)表达增加有关。
CREG1蛋白对血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心功能损伤的影响
宋海旭,李洋,孙鸣宇,彭程飞,田孝祥,,韩雅玲
解放军医学杂志 , 2015,
Abstract: 目的 探讨E1A激活基因阻遏子(CREG1)蛋白能否改善心肌纤维化小鼠的心功能。方法 应用基因打靶方法建立广泛性基因敲除的CREG1杂合子小鼠和CREG1野生型小鼠模型。应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)皮下埋泵方法建立小鼠心肌纤维化损伤模型,给予AngⅡ刺激14d后,采用HE和Masson染色检测小鼠心肌纤维化情况。应用Westernblotting和免疫组化染色技术检测给予AngⅡ前及3、7、14d后两组小鼠心肌中CREG1蛋白的表达,并于给予AngⅡ14d后应用小动物超声仪检测心功能情况。AngⅡ给药同时,以皮下埋泵方式分别给予15、30、60、300μg/(kg·d)的外源性重组CREG1蛋白(治疗组)和生理盐水(对照组)14d,检测心功能,并应用TUNEL染色和Westernblotting检测心肌凋亡情况。结果 Westernblotting和免疫组化检测结果显示,未给予AngⅡ刺激时杂合子小鼠心肌中CREG1蛋白表达明显低于野生型小鼠(P<0.05)。给予AngⅡ刺激3、7、14d时,野生型小鼠和杂合子小鼠心肌中CREG1蛋白表达均明显下降(P<0.05),但杂合子小鼠下降更为显著(P<0.01);HE和Masson染色显示杂合子小鼠心肌纤维化程度较野生型小鼠严重,二者心功能明显下降,且杂合子小鼠心功能下降更为明显(P<0.05)。给予外源性重组CREG1蛋白治疗后,治疗组心功能较对照组明显改善(P<0.05),心肌凋亡数量明显下降(P<0.05)。结论 在AngⅡ引起的小鼠心肌纤维化模型中,CREG1蛋白减少可使小鼠心功能损伤加重,给予外源性重组CREG1蛋白可明显改善心功能。
e1a激活基因阻遏子过表达诱导体外培养大鼠平滑肌细胞分化
韩雅玲?,,刘海伟?,胡叶?,康建?,王效增?,李少华?
生物化学与生物物理进展 , 2004,
Abstract: 为探讨e1a激活基因阻遏子蛋白(creg)对血管平滑肌细胞表型转换的调控机制,应用prc/cmv-hcreg真核表达载体转染体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(vsmcs),观察了转染前后细胞的表型改变.结果发现,prc/cmv-hcreg质粒转染后,大鼠平滑肌细胞增殖受抑,细胞分化标志蛋白smα-actin表达显著增加.免疫共沉淀分析发现,creg与血清反应因子(srf)发生相互作用形成复合体,在creg基因过表达时,与creg结合的srf蛋白增加.凝胶迁移阻滞分析(gsma)和抗体凝胶迁移阻滞分析(supershift)显示,过表达的creg蛋白与srf蛋白共同结合到smα-actin基因启动子区carg位点上,可能参与smα-actin表达的调控.构建smα-actinpromoter-pcat?3报告基因载体并与prc/cmv-hcreg质粒共转染vsmcs也证实,creg蛋白过表达可增强smα-actin基因表达.上述研究提示,creg蛋白可能是调控vsmcs表型转换的重要分子.
转录因子e2f1抑制creg表达调控体外培养的人血管平滑肌细胞分化
韩雅玲?,赵昕?,,康 建?,张效林?,邓 捷?,徐红梅?,刘海伟?
生物化学与生物物理进展 , 2007,
Abstract: 为探讨转录因子e2f1在血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,vsmcs)表型转化中的作用及其对e1a激活基因阻遏子(cellularrepressorofe1a-stimulatedgenes,creg)表达调控的分子机制,应用生物信息学方法,定位人creg(hcreg)基因启动子并确定转录因子e2f1在hcreg启动子区的结合位点,pcr方法克隆并构建hcreg基因启动子绿色荧光报告基因载体,以hcreg启动子区e2f1结合位点为模板,化学合成e2f1寡聚脱氧核苷酸(odn)和错配e2f1odn,利用转录因子“诱骗(decoy)”策略,用e2f1odn转染体外培养的vsmcs以阻断e2f1与hcreg基因启动子区的结合,蛋白质印迹(westernblot)分析检测阻断前后细胞内hcreg蛋白、报告基因绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,gfp)和平滑肌细胞分化标志蛋白smα-actin表达变化.结果显示:分化表型hitasy细胞中e2f1表达下调伴出核转位,而增殖表型的hitasy细胞中e2f1蛋白表达明显增加且定位于核内.进一步应用fugene6瞬时转染e2f1odn和错配e2f1odn于体外培养hitasy细胞中,蛋白质印迹分析发现,转染e2f1odn后,hitasy细胞中hcreg、smα-actin和gfp表达均较未阻断组及错配组细胞明显增加.上述研究结果证实,e2f1是hcreg基因转录的重要调控因子,能够直接结合于hcreg启动子区阻遏hcreg表达,参与hcreg蛋白对vsmcs表型转化的调控作用.
抑制rac1蛋白活化阻碍胚胎发育早期血管新生
张剑?,韩雅玲?,康建?,张效林?,齐岩梅?,,李少华?
生物化学与生物物理进展 , 2009,
Abstract: 小g蛋白rac1在胚胎发育早期血管形成尤其是内皮发生过程中的作用尚不清楚.采用胚胎干细胞(escs)为模型,建立稳定表达持续表达型rac1(g12v)和显性失活型rac1(t17n)编码序列的小鼠escs并制备胚胎小体(ebs),诱导分化后观察rac1(g12v)和rac1(t17n)对内皮细胞分化和迁移功能的影响.采用相差显微镜观察ebs发育和分化特征,pulldown分析rac1表达变化,免疫荧光染色和westernblot分析内皮分化标志物,matrigel凝胶实验观察血管索形成.结果表明,无论过表达或抑制rac1的活化,并不影响ebs发育,均可形成典型的ebs胚层结构.抑制rac1活化对内皮细胞系的发育无影响,但分化的内皮细胞不能连接成血管网.活化的rac1表达减少,细胞迁移受到明显抑制.抑制rac1活化导致细胞骨架f-actin排布紊乱.以上结果提示,rac1影响胚胎早期血管发育的因素是抑制细胞游走,后者可能是通过f-actin机制所介导.
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