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谷氨酸棒杆菌syps-062合成l-丝氨酸的代谢通量分析
张晓梅?,窦文芳?,,正宏?
生物工程学报 , 2010,
Abstract: 以一株由自然界筛选获得的能够利用糖质原料直接产l-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌corynebacteriumglutamicumsyps-062为研究对象,考察了一碳单元循环中的辅因子—叶酸和维生素b12对菌株生长、蔗糖消耗及l-丝氨酸生成的影响,同时对处于对数生长期的菌株进行了代谢流量分析。结果发现,添加扰动因子叶酸和维生素b12对磷酸戊糖途径(hmp)碳流影响较大,碳源主要用于细胞生长及合成能量,而流向目的产物l-丝氨酸的碳流减少。同时在添加维生素b12时,增大了g3p节点的l-丝氨酸合成途径的分流比,但造成三羧酸循环(tca)的流量不足,需要大量回补,从而限制了产物合成速率的进一步提高。
一株产脂肪酶嗜盐菌的鉴定及耐盐机理
张晓梅,窦文芳,,正宏
应用与环境生物学报 , 2010, DOI: 10.3724/SP.J.1145.2010.00100
Abstract: 从采自内蒙古锡林浩特地区盐湖的样品中筛选到产脂肪酶嗜盐菌jnph-3,该菌株可在含有1.5~5mol/lnacl的培养基上生长,最适生长温度45℃,最适ph7~9.5.经形态学分析、生理生化实验及16srdna鉴定,jnph-3菌株为halorubrumaidingense,属于极端嗜盐菌.jnph-3菌株在生长过程中专一性依赖na+,对cl-依赖性较小,k+浓度变化对菌体生长无明显影响.高效液相色谱分析表明,jnph-3菌株在液体复合培养基中能够产生四氢嘧啶,且与环境中盐浓度呈负相关,说明jnph-3体内除存在产生四氢嘧啶的机制来维持渗透平衡,还有其它机制来维持细胞正常生长.图3表3参14
不同供氧水平对L-精氨酸分批发酵过程的影响
,窦文芳,,张晓梅,饶志明,正宏
化工学报 , 2008,
Abstract: 以钝齿棒杆菌CorynebacteriumcrenatumSYPA5-5为研究菌株,通过不同摇瓶装液量试验,考察发酵过程中供氧对L-精氨酸合成的影响。作者分别采用发酵动力学模型和代谢流量分析对实验结果进行分析后发现:在发酵前期,高供氧使HMP途径更加活跃,生成大量NADPH促进菌体生长;高供氧控制同样利于L-精氨酸的合成,一方面是由于菌体的高葡萄糖摄入量,另一方面是由于有更多的流量从α-KG流向Arg的前体物质Glu。
桦褐孔菌菌丝体及甾类化合物的发酵条件优化
黄伟,陆震鸣,耿燕,,史劲松,正宏
菌物学报 , 2012,
Abstract: 对桦褐孔菌深层发酵培养基进行了筛选,以菌丝体及甾类化合物产量为目标对发酵条件进行了优化,确定最佳发酵条件为:30g/L葡萄糖,2.5g/L黄豆粉,2.5g/L蛋白胨,3g/LKH2PO4,0.8g/LMgSO4,0.8g/LCaSO4,初始pH4.0,接种量15%,装液量100mL/500mL,转速150r/min,28℃恒温培养。此条件下培养11d,菌丝体干重达12.52g/L,甾体类化合物的产量达112.44mg/L。
火木层孔菌发酵菌粉及其组分对小鼠移植性肝癌H22的体内生长作用
耿燕,王英辉,陆震鸣,,正宏
菌物学报 , 2013,
Abstract: 采用肝癌H22荷瘤小鼠的肿瘤模型,对火木层孔菌(桑黄)Phellinusigniarius发酵菌粉及其各提取物组分的体内抗肿瘤活性进行评价。结果表明,火木层孔菌发酵菌粉及其各提取物组分对荷瘤小鼠肝癌H22都具有一定的抗肿瘤作用并能延长荷瘤小鼠生存期,其中,火木层孔菌发酵菌粉(1,000mg/kg/d)及其组分II(多糖组分)(360mg/kg/d)具有较为显著的抗肿瘤作用,抑瘤率分别为33.5%和40.3%。组织病理学研究结果表明在菌粉及其多糖组分作用后,肿瘤细胞坏死细胞明显增多,免疫组化检测表明火木层孔菌发酵菌粉及其多糖组分能明显的降低瘤组织中Bcl-2基因蛋白的表达,提高小鼠瘤组织中的Bax基因蛋白的表达。火木层孔菌发酵菌粉及其多糖组分具有较好的体内抗肿瘤活性。
提高重组毕赤酵母表达hIFNb-HSA的碳源控制策略
张宏斌,窦文芳,,金坚,李华钟,正宏
过程工程学报 , 2007,
Abstract: 研究了重组毕赤酵母KM71/IH菌体生长阶段饥饿培养对其细胞相对活性及人b干扰素-血清白蛋白融合蛋白(hIFNb-HSA)表达的影响.结果表明,在以甘油为唯一碳源的细胞培养后期进行饥饿培养以耗尽培养基中的甘油会导致重组细胞相对活性的降低,进而减少hIFNb-HSA的表达量.在此基础上,提出了菌体培养后期,即过渡阶段流加甘露醇碳源代替饥饿培养的策略,不仅可以消除培养液中甘油残留对甲醇诱导表达hIFNb-HSA的不利影响,而且能够保持重组细胞培养物较高的相对活性(>97%),从而可以提高甲醇诱导表达hIFNb-HSA的水平,表达量可达37.3mg/L,最大生产强度为0.78mg/(L×h),较对照分别提高了92.3%和44.4%.
氨基脱氧分支酸合成酶对CorynebacteriumglutamicumSYPS-062积累L-丝氨酸的影响
苑亮,张晓梅,窦文芳,,正宏
生物技术通报 , 2011,
Abstract: 为阐明氨基脱氧分支酸合成酶(ADC合成酶)在CorynebacteriumglutamicumSYPS-062体内积累L-丝氨酸过程中的作用,通过交叉PCR以及同源重组的方法敲除叶酸途径关键酶ADC合成酶的编码基因pabAB,构建了叶酸缺陷型菌株CorynebacteriumglutamicumSYPS-062△pabAB,同时构建pabAB基因增强表达重组菌C.glutamicumSYPS-062(pJCI-pabAB)。分别考察了ADC合成酶对菌株生长的影响、对L-丝氨酸降解途径关键酶丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的影响以及其对L-丝氨酸积累的影响。结果表明,与出发菌株相比,增强表达基因pabAB重组菌的ADC合成酶的酶活力提高了33%,SHMT酶的酶活力提高了30%,其最大比生长速率(μ_m)提高了48%,单位细胞产酸率(Yp/x)降低了36.2%;而敲除基因pabAB重组菌的ADC合成酶的酶活力降低了61%。SHMT酶的酶活力降低了20%,最大比生长速率降低了32%,单位细胞产酸率提高了12%。
亮菌菌粉和亮菌糖浆品质分析比较
敖宗华,陆震鸣,孙军恩,,正宏
生物技术通报 , 2008,
Abstract: 以多糖、多肽和亮菌甲素含量以及多糖分子量分布分析为指标,对液体发酵生产的亮菌菌粉和固体发酵生产的亮菌糖浆进行质量比较。亮菌菌粉中多糖,多肽含量分别为5.86%和4.62%。亮菌菌粉和亮菌糖浆中多糖/多肽的含量比值分别为1.27和1.29。亮菌糖浆主要由小分子量多糖组成,菌粉中亮菌甲素较多。液体发酵所得的亮菌菌粉是一种有潜力的制剂新原料。
融合蛋白GGHN端延长类似物的克隆表达、纯化及活性研究
冯均尚,窦文芳,张晓梅,,史劲松,正宏
生物技术通报 , 2013,
Abstract: GGH是人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白(GLP-1A2G)2-HSA的简称,为研究N端添加丙氨酸的修饰对其活性的影响,通过基因工程方法成功构建表达该类似物的工程菌,并纯化得到终产物,完成了初步体外活性检测。首先运用PCR技术扩增出融合蛋白GGH类似物的基因片段,以pPIC9K为表达质粒构建了重组表达质粒,将双酶切和测序验证正确的重组质粒电转至分泌型菌株毕赤酵母GS115,然后经过MD平板筛选获得转化子,利用甲醇诱导表达72h,SDS-PAGE检测上清产物与未修饰的GGH对比,得到阳性转化子。融合蛋白经过发酵液8000r/min离心10min,0.45μm的微孔滤膜微滤,采用截留分子量为10kD的超滤膜超滤20倍,再依次经过BlueSepharose6FastFlow、PhenylSepharoseFastFlow、QSepharoseFastFlow、SephadexG-25层析柱。在RINm5f细胞上测cAMP的生成,通过与阳性对照的标准曲线对比发现,A-GGH活性比GGH提高10倍,表现出较好的体外活性。
直接利用糖质原料产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌glyA基因序列分析
林琳,窦文芳,张晓梅,,正宏,王正祥
生物技术通报 , 2008,
Abstract: 以能够利用糖质原料产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)SYPS-062glyA基因为研究对象,比较C.glutamicumSYPS-062与C.glutamicum模式菌株ATCC13032的glyA基因的异同。分别以SYPS-062及ATCC13032基因组为模板,利用PCR技术获得丝氨酸羟甲基转移酶编码基因glyA。核苷酸序列分析结果表明,来源于SYPS-062和ATCC13032的glyA基因片段全长均为1305bp,编码434个氨基酸,分子量为46.5kD,基因的同源性为99.54%,存在6个核苷酸的差异,引起一个氨基酸残基的突变。将获得的基因分别在大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中诱导表达。酶活测定结果显示,2种不同菌株来源的重组SHMT的比活力稍有差异,说明SYPS-062glyA基因的差异对其表达产物SHMT蛋白构型及功能影响不大。提示对于C.glutamicumSYPS-062能够利用糖质原料产L-丝氨酸的机制解析应进一步从glyA基因的转录水平、翻译水平及胞内SHMT辅酶的供给情况等方面进行深入研究探讨。
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