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ngal基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中过表达的研究
许丽艳?,李恩民?,熊华淇?,,沈忠英?
生物化学与生物物理进展 , 2001,
Abstract: 为研究ngal(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin)基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中的表达情况,以永生化食管上皮细胞系shee和食管癌细胞系sheec互为对照,用cdna微列阵进行筛选,用rna印迹和rt-pcr进行鉴定,cdna克隆测序后与genbank进行blast分析比较.结果表明ngal基因在sheec中出现显著差异过表达,其cdna序列与小鼠24p3、大鼠nrl(neu-relatedlipocalin)、人中性粒细胞ngal和卵巢癌ngal具有较高的相似性.这提示ngal基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中可能发挥着重要作用,可能是一种新的癌基因或促癌基因.
非同位素标记法检测人染色体端粒长度
许丽艳,李恩民,沈忠英,,沈 健
癌变·畸变·突变 , 2001,
Abstract: ?目的:建立一种非同位素标记测定端粒长度的方法。方法:以地高辛标记寡核苷酸(ccctaa)3为探针,对基因组dna进行southern杂交,nbt/bcip显色后与dna标准分子量比较,图象分析系统测定端粒长度。结果:通过严格控制探针的工作浓度(1:1280稀释)、dna上样量(>20μg)、杂交温度(47±2℃)等主要影响因素,获得了比较好的杂交条带。结论:建立了一种稳定、可靠、低背景的地高辛标记检测端粒长度的方法。
ngal基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体的构建与鉴定
许丽艳,李恩民,,沈忠英,曾 毅
癌变·畸变·突变 , 2004,
Abstract: ?背景与目的:构建ngal基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。材料与方法:以pcr法从sheec食管癌细胞基因组dna中扩增ngal基因5’侧翼转录调控区不同长度片段g0~g6(-1431~+84)。pcr产物经pgem-teasy转载,再定向亚克隆插入pgl3-basic。重组子通过特异限制性内切酶切割,琼脂糖电泳予以鉴定。结果:成功构建ngal基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体7个,pglb-g0~g6。结论:为借助于双荧光素酶报告基因检测系统研究确定ngal基因5’侧翼转录调控区转录调控元件的分布特点以及转录调控元件与转录调控蛋白之间相互作用的性质提供了基本实验条件。
ngal基因新型tpa反应元件结合蛋白的研究
孟令英?,缪成贵?,杜则澎?,,许丽艳?,李恩民?
生物化学与生物物理进展 , 2008,
Abstract: 以往研究发现,食管癌细胞的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,ngal)基因的过表达具有明显的12-o-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate,tpa)诱导性,在启动子-152~-60区段存在着一种新型的tpa反应元件(tparesponseelement,tre),但是该元件的结合蛋白尚未被鉴定出来.采用寡核苷酸dna亲和层析法(oligonucleotidetrapping)从食管癌细胞中分离纯化了ngal基因tre结合蛋白;经sds-page进一步分离,银染显示目标蛋白带.人工切取各目标蛋白带进行maldi-tof-ms分析,通过mascot软件搜索ncbi数据库,根据蛋白质的功能、细胞定位和分子质量大小等指标确定8个核蛋白因子:c19、kiaa1949、tdrd1、rxrβ、fam54a、klf15、klf10和yy-1.最后,利用rt-pcr验证了这些核蛋白因子表达的tpa反应性,结果表明c19、kiaa1949、tdrd1、rxrβ和klf15等编码基因的转录表现出了明显的tpa反应性,提示可能是食管癌细胞中应答tpa刺激,参与ngal基因过表达的转录激活因子.
人食管癌cdna酵母杂交文库的构建与鉴定及其应用
许丽艳?,李恩民?,牛永东?,,韩溟?,吴炳礼?,张灿?,沈忠英?,曾毅?
生物化学与生物物理进展 , 2003,
Abstract: 以往在研究由促癌物12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate,tpa)诱导的人永生化食管上皮细胞恶性变中基因的差异表达情况时,曾获得中性粒细胞明胶酶相关lipocalin(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,ngal)等新的食管癌癌变相关基因.为深入研究这些癌变相关基因在食管癌中以蛋白质-蛋白质或蛋白质-dna相互作用为基础的功能网络调控关系,建立了一个食管癌cdna酵母杂交文库.采用trizol试剂从一种新的人食管癌细胞(sheec,由人永生化食管上皮细胞转化而来)中提取细胞总rna,采用oligotexmrnakit从细胞总rna中制备polya+mrna,采用superscripttmchoicesystemforcdnasynthesiskit合成cdna,以polya+mrna为探针,化学发光法监测cdna合成的质量,以pgadt7为载体构建了sheec细胞的cdna酵母杂交文库.文库的滴度为1.19×109cfu/ml,重组片段大小主要集中在0.5~6.0kb,重组率为50%.在此基础上,应用酵母单杂交技术手段对该文库中的nf-κb元件结合因子进行了筛选,在sd/-his/-leu/[+15mmol/l3-at]缺陷培养基平板上共获得了约360个单克隆.按照平板上酵母单克隆直径的大小,选择直径大于2mm者91个,提取质粒进行酶切鉴定和一对一酵母单杂交验证实验,结果获得了30个阳性重组子,并随机取其中的9个阳性重组子进行测序和genbank/blast同源分析,发现某些基因编码的蛋白质产物在关键氨基酸残基位点上与p65和p50的nf-κb元件结合域公共序列具有高度一致性.这些实验结果表明,所构建的人食管癌cdna酵母杂交文库是成功的.
反义封闭ngal基因表达对sheec食管癌细胞微丝骨架的影响
林珏龙?,许丽艳?,李恩民?,,牛永东?,方昆阳?,熊华淇?,沈忠英?,曾毅?
生物化学与生物物理进展 , 2004,
Abstract: 为了研究反义封闭ngal基因表达对sheec食管癌细胞微丝骨架以及肿瘤细胞生物学行为的影响,以不同长度ngal基因片段反义表达载体和硫代修饰反义寡核苷酸单链片段转染sheec食管癌细胞,通过g418筛选,建立一系列旨在封闭sheec食管癌细胞ngal基因表达的亚细胞克隆.在细胞内f-肌动蛋白(f-actin)及dna荧光双标记基础上,通过流式细胞术、激光共聚焦显微镜扫描术等技术手段检测封闭反义ngal基因表达后,sheec食管癌细胞中f-actin和dna含量、f-actin形态结构以及肿瘤细胞生物学行为的变化特征.结果显示,反义封闭ngal基因表达后,sheec食管癌细胞f-actin的含量明显降低,与永生化食管上皮细胞shee相近,但细胞分裂增殖指数未见明显变化.表明反义封闭ngal基因表达对sheec食管癌细胞的微丝骨架有明显影响,而对sheec食管癌细胞的分裂增殖影响不明显.激光共聚焦显微镜扫描观测显示,反义封闭ngal基因表达可使sheec食管癌细胞f-actin分布均匀,f-actin小体减少,细胞间连接重新建立,结构较紧密,主要形态结构特征与shee细胞趋于一致.提示反义封闭ngal基因表达可对sheec食管癌细胞的微丝骨架f-actin产生明显影响,推测癌细胞的微丝骨架f-actin可能是ngal基因在sheec食管癌细胞中发挥功能的一种作用环节.
食管癌细胞ngal基因-152~-60区段存在tpa反应元件
许丽艳?,李恩民?,牛永东?,,袁华敏?,常静霞?,沈忠英?,曾 毅?
生物化学与生物物理进展 , 2006,
Abstract: 以往研究发现,在tpa诱导永生化食管上皮细胞癌变中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,ngal)基因过表达,但过表达机制不明.最近研究提示,食管癌细胞ngal启动子及其邻近区域可能存在着tpa反应元件.为了对ngal的这一tpa反应元件进行更准确定位,采用pcr法结合嵌套缺失实验从食管癌细胞中克隆了ngal5′侧翼区-152~+84、-140~+84、-78~+84、-59~+84、-50~+84、-41~+84、-37~+84、-29~+84和-10~+84等片段,并定向插入pglb、pglp或pgle等萤火虫荧光素酶报告基因表达载体中,构建了pglb-152、pglp-152、pgle-152、pglb-140、pglb-78、pglb-59、pglb-50、pglb-41、pglb-37、pglb-29和pglb-10等系列报告基因表达载体.将上述报告基因表达载体分别同prl-tk共转染食管癌细胞ec109,并用tpa刺激,检测tpa刺激转染ec109的相对荧光素酶活力,综合判定ngal-152~+84区不同长度片段的tpa反应性,对ngal启动子区的tpa反应元件给予进一步分段定位.结果表明,ngal启动子区的tpa反应元件位于-152~-60区段,而且应答tpa刺激的反应能力很强.生物信息学分析结果显示,ngal启动子区所存在的tpa反应元件很可能是一种新结构类型.研究说明,ngal在dna序列上有应答tpa刺激的结构基础,将有助于深入到分子水平揭示tpa诱导永生化食管上皮细胞癌变中ngal过表达机制,也有助于进一步认识tpa信号细胞内传递途径网络在肿瘤发生发展中的作用.
hpv18e6e7基因诱发的人胎儿食管上皮永生化和恶性转化细胞端粒长度和端粒酶活性
许丽艳,沈忠英,李恩民,,沈 健,李 淳,洪超群,陈炯玉,曾 毅
癌变·畸变·突变 , 2001,
Abstract: ?目的:探讨端粒长度、端粒酶活性以及端粒酶亚单位组分(htert、htr)的表达与食管上皮细胞永生化和恶性转化之间的关系。方法:对hpv18e6e7基因诱发的人胎儿食管上皮永生化细胞系shee和恶性转化细胞系sheec,通过southernblot检测端粒长度(trf),trap法测定端粒酶活性,rt-pcr研究端粒酶催化亚单位(htert)和端粒酶rna成分(htr)的表达。结果:shee细胞和sheec细胞的端粒平均长度比正常食管上皮细胞的明显缩短,但稳定维持在一定长度范围内。shee细胞和sheec细胞均具有端粒酶活性,并均有htert和htr表达。结论:端粒酶表达活化使端粒维持在一定长度是永生化食管上皮细胞shee和恶性转化细胞sheec能够稳定分裂增殖的重要因素之一。
白桦酯醇对食管癌细胞ec109的抑制作用
,马云青,祁逸梅,牛永东,许丽艳,李建新,李恩民
癌变·畸变·突变 , 2006,
Abstract: ?背景与目的:白桦酯醇是一种重要的三萜类生物活性分子,本文从白桦树皮中提取获得白桦酯醇纯品,然后研究该生物活性分子抑制食管癌细胞的活性。材料与方法:取一定量的白桦树皮干粉,通过乙醇回流,减压浓缩和甲醇-氯仿重结晶等步骤获得白桦酯醇纯品。用不同剂量的白桦酯醇作用于ec109食管癌细胞48h,噻唑蓝(methylthiazoletetrazolium,mtt)法检测细胞抑制率。结果:白桦酯醇作用于食管癌细胞ec109后,ec109细胞形态发生明显改变,细胞抑制率随白桦酯醇浓度的增高而增高,呈现剂量依赖关系。结论:白桦酯醇对食管癌细胞ec109有明显抑制活性。  
清江流域梯级电站建设工程造价控制程序与方法
,徐涛
科技进步与对策 , 2001,
Abstract: 清江梯级电站是按照“业主负责、建管结合、流域开发、滚动发展”的开发思路进行建设的,前一个电站建成后的发电收益将成为下一个电站建设的资本金来源,工程造价控制水平将直接影响电站的固定资产投资规模以及发电后的上网电价水平和电价竞争能力,因此也必须影响梯级电站建设的滚动开发能力。梯级电站建设的工程造价控制必须从工程项目前期评估、市场分析和预测开始,在涉及项目预可研、可行性研究阶段、招标设计阶段、工程施工期等各时期,各个环节统一考虑。控制方法梯级电站控制程序清江流域工程造价可研阶段经济评价施工期预可研阶段
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