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枯草芽孢杆菌寡聚1,6-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
,马立新
微生物学报 , 2002,
Abstract: 本研究用鸟枪法构建了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HB002的基因组文库,经平板法筛选得到了六株能水解合成底物对硝基苯αD葡萄糖吡喃糖苷的阳性克隆,经鉴定均含克隆了寡聚1,6葡萄糖苷酶基因的重组质粒(命名为pHBM001~pHBM006)。选择pHBM003,对其插入片段测序分析,此片段内有一编码561个氨基酸的开放阅读框,该蛋白质的计算分子量为65985kD。HB002的寡聚1,6葡萄糖苷酶的氨基酸序列与Bacillus sp.和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)的寡聚1,6葡萄糖苷酶的氨基酸序列一致性分别为81%、67%,相似性分别为89%、79%。从pHBM003中扩增出寡聚1,6葡萄糖苷酶基因,克隆到pBV220上,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,得到三个能水解对硝基苯αD葡萄糖吡喃糖苷的阳性克隆HBM0031~HBM0033,将此三个菌株热诱导表达,SDSPAGE电泳可检测到特异表达的蛋白质,其中HBM0031、HBM0032表达的蛋白约66kD,为完整的寡聚1,6葡萄糖苷酶,而HBM0033表达的蛋白质偏小;表达的蛋白质均有寡聚1,6葡萄糖苷酶活性。
适用于细菌与植物互作研究的gusA启动子探针载体pHN112的构建
史巧娟,马立新,,周俊初
生物工程学报 , 1999,
Abstract:
甘蓝型油菜羧基转移酶α亚基全长cdna的克隆及在大肠杆菌中表达
武玉永?,马立新?,
生物化学与生物物理进展 , 2004,
Abstract: 通过分析拟南芥与大豆的羧基转移酶α亚基的cdna序列,运用rt-pcr、race和基因组步行(genomewalking)三种技术进行组合克隆,首次从油菜开花后20~29天的幼胚中,克隆到质体定位的羧基转移酶α亚基的全长cdna.同源性分析表明,其开放阅读框(orf)编码的氨基酸序列与拟南芥、大豆的羧基转移酶α亚基的同源性分别为85%、59%.将此cdna去除叶绿体转运肽编码序列的成熟肽编码序列,克隆到表达载体phbm625上,蛋白质印迹分析,它在大肠杆菌中成功表达.
适用于细菌与植物互作研究的gusa启动子探针载体phn112的构建
史巧娟 马立新** ** 周俊初***
生物工程学报 , 1999,
Abstract:
利用抑制差减杂交技术分离受水稻抗性调控的褐飞虱基因
杨之帆,陈永勤,李春华,
昆虫学报 , 2009,
Abstract: 为分离受水稻抗性调控的褐飞虱Nilaparvatalugens基因,以取食感虫水稻台中1号和高抗水稻B5的2叶1芯秧苗24h的褐飞虱4龄若虫为起始材料,采用抑制差减杂交技术构建了两个群体间的正反向差减cDNA文库。通过斑点杂交从差减文库中筛选代表受水稻抗性调控的基因的cDNA克隆,进行测序和功能分析,挑选具功能的基因进行Northern杂交验证。结果表明,通过斑点杂交筛选到的98个阳性克隆代表92个互不重复的单基因,其中25个与动物的已知蛋白基因存在较高的同源性。Northern杂交表明,这25个基因有11个表达上调,8个表达下调,提示它们可能在褐飞虱适应抗性水稻过程中发挥了重要作用。本研究结果为克隆上述新基因的全长cDNA序列及进一步研究其在褐飞虱与水稻互作中的功能奠定了基础。
褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基全长cDNA序列的克隆及分析
杨之帆,陈俊,,陈永勤
生物技术通报 , 2009,
Abstract: 利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆了褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基(NQO)基因的全长cDNA片段,并进行了核苷酸序列测定。结果表明,该cDNA片段长度为1930bp,所编码的蛋白与家牛、小家鼠、食蟹猴、人和蟾蜍的NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基的氨基酸序列的同源性分别达到77%、76%、76%、75%和75%。Southern杂交分析表明,NQO基因在褐飞虱基因组中以单拷贝形式存在。
抗tnf-α/抗ed-b双特异抗体在酵母中的分泌表达与活性分析
胡雪平?,谢冕?,李路军?,,刘梦元?
生物工程学报 , 2015, DOI: 10.13345/j.cjb.140350
Abstract: 赋予抗tnf-α单链抗体片段(tnf-scfv)对炎症组织的特异性,用一段来自人清蛋白(hsa)的柔性连接肽在基因水平上连接tnf-scfv和抗b型纤维连接蛋白(b-fn)的额外域b(ed-b)的scfvl19,构建了抗tnf-α/抗ed-b单链双特异抗体bsdb,其中b-fn为炎症组织中特异表达的抗原。bsdb在毕赤酵母中获得了分泌表达,表达产物经鉴定和纯化制备后,进行了功能分析。结果表明,bsdb保留了其亲本抗体tnf-scfv和l19对抗原的免疫反应性,能够同时结合tnf-α和ed-b,并中和tnf-α的生理作用。而且,bsdb对抗原的亲和力及中和能力与大肠杆菌包涵体来源的亲本抗体相比显著增强。在小鼠佐剂型关节炎(aia)模型中,bsdb能选择性地积累和保留于小鼠的炎症关节,并快速从血浆中清除。说明bsdb兼备炎症组织的特异性和正常组织的低毒性,在类风湿关节炎及其他慢性炎症性疾病的治疗上具有较大潜力。
不同压力作用下太湖蓝藻气囊体积分数及上浮特性研究
王巍,丛海兵,徐亚军,陈雯,,吴军,新跃
环境科学 , 2014,
Abstract: 为了探明不同压力作用后蓝藻气囊体积变化规律及其上浮特性,分别采用压力毛细管法和图像分析法测定了不同压力作用后铜绿微囊藻气囊破裂情况及残余气囊体积分数,以及压力作用后气囊恢复生长情况.结果表明,采用图像分析法测得太湖蓝藻经0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7MPa加压后,藻细胞内的气囊体积分数分别为29.52%、5.73%、4.43%、2.71%、2.46%、2.19%,传统的压力毛细管法测得的气囊体积分数为10.93%、1.14%、0.90%、0.27%、0.14%、0.04%.作用压力大于0.4MPa时,蓝藻因气囊破裂而下沉,沉淀蓝藻经过一段时间培养后气囊逐步恢复,部分藻类再上浮,在1000lx光照度、25℃条件下培养8、24、48h后,藻细胞再生气囊占加压前气囊总体积的比例为31.02%、45.68%、81.05%.图像分析法较准确地测定了蓝藻气囊体积,而传统的压力毛细管法测定蓝藻气囊体积偏小.
构建定向t载体用于基因克隆和表达
钟星?,翟超?,陈亮?,余晓岚?,,严红?,杨登想?,马立新?
生物工程学报 , 2013,
Abstract: 传统的t载体克隆方法需要烦琐的后续步骤来筛选和鉴定重组子,并且无法实现目的基因的定向克隆。为了克服这些问题,本研究在pet-23a(+)的基础上构建了定向t载体petg,首先通过定点诱变消除pet-23a(+)上的两个bfuⅰ位点得到pet-23am;设计一对引物在5¢端各引入一个bfuⅰ位点,下游引物紧邻bfuⅰ位点引入13bp的部分laco序列,用该引物从phbm2002上扩增prrn-gfp表达盒,插入pet-23am的ndeⅰ和xhoⅰ位点,得到定向t载体petg。pcr扩增的目的基因通过下游引物引入7bp剩余的laco序列,该基因片段与bfuⅰ酶切制备的定向t载体连接、转化大肠杆菌dh10β感受态细胞,通过补加了x-gal的平板筛选蓝色重组子。质粒酶切和pcr鉴定表明蓝色菌落全部为定向插入的重组子,重组效率100%,利用本方法成功地定向克隆了103个人类肝蛋白编码基因cdna,克隆过程无需复杂的步骤筛选鉴定重组子。随机选择了其中的8个基因的克隆进行表达,结果显示8个克隆均在大肠杆菌中获得成功表达。该结果表明定向t载体构建成功,并且该载体非常适合基因的克隆和表达。
Cloning and expression in Pichia pastoris of an alkaline mannanase gene
耐碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

TAN Xiu-hua,WU Yu-yong,MA Li-xin,JIANG Si-jing,
谭秀华
,武玉永,马立新,

微生物学报 , 2005,
Abstract: A strain containing alkaline mannanase gene was isolated from soil by functional plates and the genome library was constructed. From it a mannanase gene TM1 was acquired and was sequenced. The BLAST analysis showed a lower-than-60% similarity of the amino acid sequence to those in GenBank and proved TM1 to be a new mannanase gene (GenBank accession number AY623903). The new gene without signal peptide was cloned into the Pichia pastoris expression vector pHBM905C. The recombinant plasmid pHBM1201 was digested by Sal I and transformed into Pichia pastoris KM71, GS115, SMD1168, respectively. All of the recombinant Pichia pastroris strains containing pHBM1201 secreted functional beta-mannanase. Because of its high mass of expression, the recombinant Pichia pastoris SMD1168-3 containing pHBM1201 was induced at shake flasks. The optimal temperature and pH of the beta-mannanase produced by the recombinant strains were 55 degrees C and 7.5, respectively. The enzymatic activity for konjak powder reached 41.8 with a half life of one hour. After keeping at 80 degrees C for 5 min, the enzymatic activity declined from 77% to 11% and the enzymatic activity could recover up to more than 60% when the temperature descended to 55 degrees C.
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