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High Cell Density Culture of the Engineered Escherichia coli Strain Haboring hAGN Gene
血管生成抑制素基因工程大肠杆菌的高密度发酵研究

周涟,进贤,张添元
微生物学报 , 2003,
Abstract: 用5L发酵罐研究了E.coli TG1/pBVA2和E.coli TG1/pBVK13的高密度培养工艺,确定了诱导及补料策略,在不降低外源基因表达量的前提下,工程菌TG1/pBVA2高密度发酵菌体干重为16.8g/L,hAGN(K1-4)的表达量为菌体总蛋白的24.1%,相当于1.39 g/L;同样的方法, 工程菌TG1/pBVK13菌体干重可达16g/L, hAGN(K1-3)占菌体总蛋白25.8%,相当于1.45 g/L。
大麦α-淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌
进贤,李政海,李文
中国科学 生命科学 , 1998,
Abstract: 将大麦α淀粉酶和黑曲霉糖化酶cDNA重组进同一大肠杆菌酵母穿梭质粒构建含双基因的表达分泌载体pMAG15.用原生质体转化法将pMAG15引入酿酒酵母(S.cerevisiae?GRF18),在酵母PGK基因的启动子和转录终止信号及本身的信号序列的调控下,实现大麦α淀粉酶和糖化酶的高效表达,99%以上的酶活力分泌至培养基中.构建的酿酒酵母菌株GRF18(pMAG15)在含15%可溶性淀粉的培养基中,培养47h能水解99%的淀粉,并能发酵产生酒精
嗜铬粒蛋白n端片段基因在枯草杆菌中的表达及表达产物的活性分析
李瑞芳 进贤* 张添元
生物工程学报 , 2004,
Abstract: 嗜铬粒蛋白(cga)是存在于分泌细胞的由439个氨基酸组成的可溶性蛋白。近年的研究发现cga的n端具有抗血管收缩、抗细菌和抗真菌的功能。为了寻找高效低毒的抗真菌片段,利用pcr技术扩增了编码人嗜铬粒蛋白n端1-76位氨基酸(cga1-76)的dna片段,并将之克隆进本实验构建的枯草杆菌诱导型表达载体psbptq,获得含cga1-76基因的重组质粒psvtq,转化蛋白酶三缺陷的枯草杆菌db403。经蔗糖诱导后,cga1-76片段在枯草杆菌db403(psvtq)中获得表达,产物分泌到细胞外,分泌量约为5mg/l,占总分泌蛋白的133%。测试了表达产物对几种丝状真菌和酵母的抑制作用,发现在4μmol/l的浓度下,枯草杆菌表达的重组cga1-76对镰刀菌、链格孢霉及白假丝酵母有明显的抑制作用。
α-淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌
进贤,何鸣,李文清,张添元
生物工程学报 , 1994,
Abstract: 将地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cDNA重组进大肠杆菌.酵母穿梭质粒,转化酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母工程菌。酶活力测定和酶学性质分析的结果显示:在酵母MF—αl因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号的调控下,α-淀粉酶和糖化酶基因在酵母中获得高表达并向胞外分泌这两种酶。构建的酵母工程菌在含10%淀粉的培养基中6天内能水解97%的淀粉。重组质粒能在酵母中较稳定地存在。
Cloning and Expression of Kringle 1-3 Gene of Human Plasminogen and the Purification and Bioactivity of Its Expressed Product
人纤溶酶原K1-3基因的克隆、表达和产物的纯化及抗癌活性分析

张添元,进贤,陆幸妍
生物工程学报 , 2002,
Abstract: 纤溶酶原K13功能区是近年发现的血管生成抑制因子,具有抑制肿瘤生长和转移的活性。以人血管生成抑制素cDNA为模板用PCR技术扩增了K13功能区的基因,DNA序列分析后克隆至质粒pPIC9K上获得重组质粒pPIC9K13,转化毕节酵母GS115,用PCR和G418法筛选高拷贝转化子,进行摇瓶发酵。SDSPAGE和Western blot分析结果证实K13基因已在GS115分泌表达,并具有免疫活性。选用30L和80L罐进行高密度发酵,甲醇诱导48h细胞密度达到OD250~300,比摇瓶提高5~6倍,表达量150200mg/L。发酵上清液经Streamline SP离子交换及PhenylSephorose疏水层析纯化,在SDSPAGE上显示一条带,纯度96%,动物实验证明纯化产物具有抗血管生成和抗肿瘤的活性。 
双功能质粒pCB33的构建及性质研究
进贤,周祯林,李镇林
遗传 , 1987,
Abstract: 枯草杆菌具有安全性好、产胞外蛋白、产品中不含内毒素等优点,是基因克隆的理想受体,但也存在某些外源基因不能表达、用鸟枪法克隆外源基因比较困难等缺点。若能构建可在大肠杆菌和枯草杆菌中复制和表达的双功能质粒作为载体,以大肠杆菌为中间寄主,利用其转化率高,克隆技术比较成熟的优点,先将DNA片段克隆至大肠杆菌,经过鉴定后再转至枯草杆菌中表达,则可克服枯草杆菌克隆
枯草杆菌诱导型高效表达-分泌系统的构建
吴青,进贤,徐柏年,李文清
自然科学进展 , 2001,
Abstract: 利用枯草杆菌蛋白酶缺陷突变株,sacB诱导基因及degQ,degU(Hy)正调控基因构建了诱导型表达-分泌系统以解决枯草杆菌分泌大量胞外蛋白酶和外源基因表达水平不高的问题.采用共转化方法将枯草杆菌IA95的degU(Hy)突变引入枯草杆菌蛋白酶缺陷突变株DB403,获得degU(Hy)和蛋白酶三缺陷的新菌株DB1342;利用sacB基因的启动子--信号序列及芽孢杆菌的两个正调控基因degQ和degU(Hy)构建了诱导型表达-分泌载体pURT3及pURTQ4,由DB1342突变株及pURT3及pURTQ4载体组成枯草杆菌诱导型高效表达和分泌系统.在本系统中内源基因sacB的表达量是原菌株DB403的296倍,将地衣杆菌α-淀粉酶基因引入本系统后在sacB,degQ,degU的调控和蔗糖的诱导下,α-淀粉酶的表达量是在DB403中的140倍,证实degQ及degU对基因表达的增强作用是叠加的.
人血管生成抑制素基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达
进贤,卢文菊,李文清
自然科学进展 , 2000,
Abstract: 血管生成抑制素是新发现的一种血管生成抑制因子,能抑制肿瘤的生长和转移,有临床应用前景.根据血管生成抑制素是纤溶酶原的一个内片段的特点,以人纤溶酶原cDNA为模板,用PCR扩增出人血管生成抑制素基因,经序列分析后克隆至质粒pBV220转化大肠杆菌DH5α,在温度诱导下获得高效表达.SDS-PAGE及West-ern印迹分析显示:表达产物占菌体总蛋白的38%,相当于212mg/L,并具有免疫活性.生物活性分析结果表明,重组人血管生成抑制素能抑制bFGF诱导的CAM血管生成、抑制C57BL/6小鼠皮下原位B16黑色素瘤生长.
钙网蛋白122~180片段基因克隆、表达和活性分析
陈宏?,张添元?,进贤,胡志上?
生物化学与生物物理进展 , 2004,
Abstract: 钙网蛋白是高等动物细胞中普遍存在的一种钙结合蛋白,近年发现它及其n端1~180位氨基酸能抑制内皮细胞生长和血管生成.为了寻找高效和小分子质量的血管生成抑制因子,用pcr技术扩增出钙网蛋白n端122~180位氨基酸的dna序列,克隆进原核表达载体pet-3c,转化大肠杆菌bl21(de3),经iptg诱导后,该片段以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的35.4%.包涵体经变性溶解、复性和初步纯化后,纯化产物可以抑制人脐静脉内皮细胞的生长,鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成和小鼠原位黑色素瘤的生长.
α-淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌
进贤 何鸣 李文清 张添元
生物工程学报 , 1994,
Abstract: 将地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cdna重组进大肠杆菌.酵母穿梭质粒,转化酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母工程菌。酶活力测定和酶学性质分析的结果显示:在酵母mf—αl因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号的调控下,α-淀粉酶和糖化酶基因在酵母中获得高表达并向胞外分泌这两种酶。构建的酵母工程菌在含10%淀粉的培养基中6天内能水解97%的淀粉。重组质粒能在酵母中较稳定地存在。
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