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诱导处理小麦对蚜虫生长发育的影响及小麦特异基因的表达
传书,赵惠燕
应用生态学报 , 2006,
Abstract: 分析了麦二叉蚜在小麦98-10-30上不同诱导处理后发育时间、成虫重量和平均相对生长率,以及不同诱导处理下小麦98-10-30特异基因的表达.结果表明,用针刺、蚜虫取食和bth(benzo(1,2,3)thiadiazole-7-carbothioicacids-methylester)处理98-10-30后,蚜虫发育成成虫的时间缩短,成虫体重下降,平均相对生长率在各处理间无显著差异.对处理后小麦体内特异基因的表达研究表明,lox、aos、pdf1.2、pal1、pr-1和bgl2基因在mrna的表达量或质上存在差异.pdf1.2基因在蚜虫取食后mrna的量显著增加,但bth处理却不诱导pdf1.2基因的表达,同时,bgl2基因在蚜虫取食和bth处理后,mrna的量增加,但对照和针刺处理后bgl2基因不表达.不同诱导处理表明,98-10-30诱导的抗性对麦二叉蚜的生长发育有一定影响,蚜虫取食诱导的防卫反应与机械损伤和bth处理有相似或相同之处,但存在明显差异.这说明蚜虫诱导的抗性是一种特异反应,与受伤反应和抗病反应有重叠交叉之处,但又不同于二者诱导产生的抗性反应.
麦二叉蚜取食两种不同抗性小麦所引起的基因表达差异
传书,赵惠燕
植物保护学报 , 2006,
Abstract: 用RT-PCR和cDNA-AFLP方法研究了两个不同抗性水平的小麦品种在不同危害时间后6个特异选择的基因和全部基因的差异表达。结果表明,在感蚜品种千斤早中,48hLOX表达最充分,而在抗蚜品种ASTRON中,LOX基因在72h时才表达最强。AOS基因在感蚜品种千斤早中与LOX表达一致,48h表达最强,在抗蚜品种ASTRON中,AOS基因持续表达。PDF1.2基因在抗蚜品种ASTRON中持续表达,但在感蚜品种千斤早中仅在48h有较强的表达。PAL基因在不同时间段内都无明显表达差异。PR-1基因在抗蚜品种ASTRON中,在72、96h诱导表达,而在感蚜品种千斤早中不表达。BGL2基因在抗蚜品种ASTRON中,48h后有较强的表达,而在感蚜品种千斤早中也无明显表达。通过cDNA-AFLP分析,进一步验证了不同危害时间、不同品种间的基因差异。从这些差异的基因中分离了10个基因并对其序列进行了分析,结果表明,蚜虫取食诱导的防卫反应涉及十八烷酸途径和病菌相关蛋白。
雷公藤hmgr基因克隆、序列分析及诱导表达
武 莹?,李 威?,传书
西北农林科技大学学报(自然科学版) , 2012,
Abstract: 【目的】克隆雷公藤萜类生物合成途径限速酶hmgr的编码基因,并分析雷公藤叶悬浮细胞中该基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达水平,为雷公藤萜类生物碱的生物合成提供理论依据。【方法】根据genbank中报道的限速酶hmgr的编码基因序列合成简并引物,采用rt-pcr、5′-race和3′-race方法从雷公藤叶片中获得hmgr基因的cdna全长序列;用生物信息学方法对限速酶hmgr进行蛋白结构及功能分析;用半定量rt-pcr方法比较hmgr基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达差异;用hplc分析不同质量浓度壳寡糖诱导下雷公藤叶悬浮细胞中3种萜类次生代谢物(内酯醇、吉碱和次碱)的含量。【结果】获得了雷公藤中编码限速酶hmgr的基因全长cdna序列,该序列开放阅读框长为1860bp,编码579个氨基酸。生物信息学分析表明,雷公藤hmgr基因编码的蛋白分子质量为61.678ku,等电点为6.98,蛋白质稳定性参数为41.33,为不稳定蛋白质,氨基酸序列包含2个与nadph结合的位点(damgmnm和vgtvgggt)及2个与hmg-coa结合的位点(empvgyvqip和ttegclva)。半定量rt-pcr结果表明,经50mg/l壳寡糖诱导12h的雷公藤叶悬浮细胞中hmgr基因表达最强,且在该诱导条件下细胞中的内酯醇、吉碱和次碱的含量也有不同程度的提高。【结论】雷公藤hmgr蛋白可能为甲羟戊酸(mva)途径中的限速酶,编码该蛋白的hmgr基因可促进雷公藤萜类物质的合成。
Effects of elicitors on aphid growth and development and on specific genes expression in wheat
诱导处理小麦对蚜虫生长发育的影响及小麦特异基因的表达

ZHU Chuanshu,ZHAO Huiyan,
传书
,赵惠燕

应用生态学报 , 2006,
Abstract: This paper studied the development duration,adult weight,and mean relative growth rate(MRGR) of aphid Schizapis graminum,and the specific genes expression in wheat variety 98-10-30(Triticum aestivum) after treated with different elicitors.The results showed that needling penetration,aphid feeding and BTH application could shorten the development duration of the aphid and decrease its adult weight,but had no significant effect on aphid MRGR.Different elicitors induced different specific genes expression in quality and quantity.The mRNA of PDF1.2 was increased significantly after aphid feeding,while there was no expression after applying BTH.Aphid feeding and BTH application increased the mRNA of BGL2,but no expression was observed in the control and after needling penetration.The induced resistance had some effects on aphid growth and development,and the response induced by aphid feeding had some similarities but significant differences to that induced by mechanical wounding and BTH application.It could be concluded that the response of aphid to elicitors was a special resistance,and there existed some overlaps or differences between it and mechanical wounding and SAR(systemic acquired resistance).
雷公藤中雷公藤甲素、雷公藤吉碱和次碱的高效液相色谱-电喷雾串联质谱分析方法
Determination of triptolide, wilforgine and wilforine in Tripterygium wilfordii by high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry

张璟,陈蒙蒙,蒲时,传书,张兴
- , 2018,
Abstract: 建立了一种高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(HPLC-ESI-MS/MS)测定雷公藤提取物中雷公藤甲素(triptolide)、雷公藤吉碱(wilforgine)和雷公藤次碱(wilforine)3种活性物质的分析方法,比较了雷公藤不同植株部位和不同组织培养产物中3种活性物质的含量差异。分别采用回流和超声两种方法提取。回流提取中,样品经V(甲醇):V(乙腈)=1:1溶液回流,采用Supelclean LC-Si固相萃取小柱净化;超声提取中,样品经乙醇超声,用OASIS HLB固相萃取柱净化。采用C18色谱柱分离,乙腈和水作为流动相进行梯度洗脱,采用HPLC-ESI-MS/MS测定。结果显示:在雷公藤植株中,雷公藤甲素含量最高的是不定根,发状根、根皮中含量次之,茎、叶中含量很少;雷公藤次碱含量最高的是发状根,其次是根皮,叶中未检测出;发状根和根皮中雷公藤吉碱的含量相当。在0.01~2 mg/kg添加水平下,3种活性物质的回收率在81%~109%之间,相对标准偏差(RSD)为0.4%~1.8%(n=5)。检出限在0.08~0.12 μg/mL之间。该方法可以准确、快速地对雷公藤提取物及其产品进行质量监控。
A rapid analytical method for the simultaneous determination of triptolide, wilforgine and wilforine was developed using high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). The contents of those three active substances in different tissues and plant tissue culture of Tripterygium wilfordii were compared. The ultrasonic extraction and reflux extraction technologies were used for extraction of those three active substances in T. wilfordii. In the reflux extraction process, the analytes were extracted by V (methanol):V (acetonitrile)=1:1 solution, and cleaned up by Supelclean LC-Si solid phase extraction cartridges. During the ultrasonic extraction, the analytes were extracted by ethanol, purified by OASIS HLB SPE column, and separated on a reversed phase C18 column with gradient elution with acetonitrile and water as the mobile phase. The extract was then determined with HPLC-ESI-MS/MS. The results showed that the highest contents of triptolide is detected in adventitious roots, followed by hairy root and root bark, while very low content was detected in stems and leaves. The highest contents of wilforgine content is observed in hairy root, followed by the root bark, and it was not detected in leaves. Wilforine contents determined in hairy root and root bark are similar. When the addition level ranged from 0.01 mg/kg to 2 mg/kg, the recoveries of three active substances of T. wilfordii was 81%-109%, and with RSD ranged from 0.4% to 1.8% (n=5). The detection limits of the three active substances ranged from 0.08 μg/mL to 0.12 μg/mL. Results indicated that this method is highly efficient, with good sensitivity and accuracy, which can quickly monitor the quality of T. wilfordii extract and its products.
雷公藤1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸还原酶基因(twdxr)的克隆与表达分析
传书,陈欣,郭嘉,缪国鹏,冯俊涛,张兴
农业生物技术学报 , 2014,
Abstract: ?1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸还原酶(1-deoxy-d-xylulose5-phosphatereductoisomerase,dxr)是植物萜类代谢通路中丙酮酸磷酸甘油醛途径的关键酶,该酶在植物细胞中的含量可以影响植物萜类物质的合成。利用rt-pcr(reversetranscriptionpolymerasechainreaction)和race(rapidamplificationofcdnaends)技术对雷公藤萜类生物合成途径中的关键酶1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸还原酶基因(1-deoxy-d-xylulose5-phosphatereductoisomerase,twdxr)进行了克隆和表达分析研究,结果表明,twdxr基因全长1674bp,其中包含1410bp的开放阅读框,编码469个氨基酸(genbank登录号:no.kj174341)。与毛白杨(populustrichocarpa)等植物中的dxr基因有很高的同源性,跨膜结构分析dxr肽链位于膜外;实时荧光定量pcr(real-timepcr)检测表明,twdxr和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coareductase,twhmgr)在不同雷公藤组织中均有表达,其中twdxr在叶中的表达量最大;twhmgr基因在不定根中的表达量最高;诱导因子agno3(ag+)和茉莉酸甲酯(meja)处理促进雷公藤不定根中twdxr和twhmgr的表达,其中用30mmol/lag+处理后,dxr基因表达量在第4天达到最大值,hmgr基因表达量在第2天达到最大值;用50mmol/lmeja处理后,dxr与hmgr基因的表达量均在第2天达到最大值;高效液相色谱(high-performanceliquidchromatography,hplc)检测表明,用30mmol/lag+处理后,内酯醇在不定根中的积累量在第4天达到最大值,与dxr基因表达相一致,次碱的积累量在第6天达到最大值;用50mmol/lmeja处理后,内酯醇和次碱在不定根中的积累量均在第6天达到最大值。研究结果为阐明dxr基因在调控雷公藤萜类化合物生物代谢途径中的机理及提高雷公藤萜类次生代谢物质含量提供了基础资料。
雷公藤胚状体培养合成雷公藤甲素与总生物碱的初步研究
传书,冯慧娜薛璐莎,杨广隶,冯俊涛,张兴
农业生物技术学报 , 2013,
Abstract: ?雷公藤(tripterygiumwilfordiihook.f.)是一种多年生的木质藤本植物,生长周期长,次生代谢产物含量低,野生自然资源已经无法满足对其药用与农用的需求。为解决自然资源的短缺并保护雷公藤植物野生资源的生态环境,通过细胞工程技术生产雷公藤药用与农用活性物质是解决自然资源短缺,保护生态环境的途径之一。本研究中的雷公藤愈伤组织诱导自扦插一年生雷公藤叶片,将获得的愈伤组织建立细胞悬浮体系,诱导悬浮细胞得到生长稳定的胚状体培养体系。研究结果显示,添加60ml/l椰汁的1/2ms液体培养基可诱导愈伤组织形成浅绿色的胚状体,分离后的胚状体在1/2ms添加0.5mg/la-萘乙酸(naa)的液体培养基中可继续增殖分化。通过对接种量、培养基、装液量和ph值等培养条件的筛选和优化,在1/2ms培养基添加1.0mg/lnaa和30g/l蔗糖,胚状体接种量为1.5g/100ml,ph值调至5.8,250ml三角瓶中装液量为120ml时最适合胚状体的培养生长;添加内生真菌诱导子,以生物量为指标,在1/2ms+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+y1(叶的内生菌),ph5.8时雷公藤甲素在胚状体中的含量是叶中的1.07倍,是自然根皮粉中的1.44倍;在1/2ms+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+g4(根的内生菌),ph5.8时胚状体中总生物碱量17.02倍于叶中总生物碱量,1.46倍于自然根皮粉中总生物碱量。对3龄小菜蛾(plutellaxylostella)的毒杀试验表明,胚状体提取物与根皮粉提取物相似,100mg处理浓度下,72h时死亡率均在90%以上。通过雷公藤叶愈伤组织诱导的雷公藤胚状体培养体系,其次生代谢物(雷公藤甲素与雷公藤总生物碱)含量与野生雷公藤叶和根皮中的相当,胚状体提取物的杀虫活性与雷公藤根皮粉的杀虫活性无明显差异,说明雷公藤胚状体可作为解决雷公藤植物资源短缺的一条途径,为进一步研究和利用雷公藤这一植物资源提供基础资料。
紫外(uv-b)及超声波处理对雷公藤悬浮细胞中三种次生代谢物含量的影响
传书,冯明星,缪国鹏,冯俊涛,张兴
农业生物技术学报 , 2013,
Abstract: ?目前已经找到一种由雷公藤(tripterygiumwilfordiihook.f.)细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法,但是这种方法生产的次生代谢物产量较低,因此本研究利用紫外光(uv-b)辐照和超声波处理对雷公藤悬浮培养体系中萜类次生代谢物的含量进行了检测分析。在雷公藤悬浮细胞的不同培养时期,利用不同时长的uv-b辐照和超声波分别处理的雷公藤悬浮细胞和培养体系,采用高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,hplc)对悬浮细胞和培养液中雷公藤内酯醇、吉碱和次碱的含量进行测定。结果表明,利用uv-b辐照和超声波处理均可以显著提高雷公藤悬浮培养体系中悬浮细胞生长量及其次生代谢物的含量。紫外辐照及超声波处理均可使雷公藤悬浮细胞的生长量比对照提高1~2倍。在雷公藤悬浮细胞生长周期的第13天用uv-b辐照90min,雷公藤悬浮细胞中内酯醇、吉碱和次碱产物含量达到最大,分别为5.185、39.747和42.189μg/l;超声波处理40s时,次生代谢物含量达到最大,分别为5.185、40.080和45.472μg/l,与对照相比提高1~3倍。另外超声波处理对雷公藤悬浮细胞中次生代谢物释放分泌入细胞培养液中有一定程度的促进作用,通过对雷公藤悬浮细胞培养液中次生代谢物含量的检测发现,在处理时长分别为40s时,内酯醇、吉碱和次碱的转化率分别达到93.7%、86.6%和88.1%,与对照相比含量提高1~3倍。本研究为解决雷公藤野生资源短缺,利用雷公藤悬浮细胞培养生产雷公藤内酯醇、吉碱和次碱提供基础资料。
雷公藤AP2/ERF转录因子基因的克隆与分析
传书,,,陈蒙蒙,,,冯俊涛,,
- , 2018,
Abstract: 该研究以雷公藤发状根为材料,根据雷公藤根转录组数据设计引物,采用RT PCR方法克隆得到2个雷公藤AP2/ERF转录因子,分别命名为TwAP2/ERF1基因(GenBank登录号:GAVZ01042389.1)和TwAP2/ERF2基因(GenBank登录号:GAVZ01016765.1)。TwAP2/ERF1基因含有一个525 bp开放阅读框(ORF),编码186个氨基酸;TwAP2/ERF2基因的ORF为789 bp,编码262个氨基酸;2个基因编码的蛋白质均为亲水性蛋白质。系统进化分析表明,TwAP2/ERF1与油桐(Vernicia fordii)AP2/ERF(APQ47444.1)和木油桐(Vernicia montana)AP2/ERF(APQ47365.1)相似性较高,TwAP2/ERF2与毛果杨(Populus trichocarpa)AP2/ERF(XP_002304640.1)和樱桃(Prunus pseudocerasus)AP2/ERF(ALD84477.1)相似性较高。雷公藤发状根经MeJA诱导后,TwAP2/ERF1基因的相对表达量明显提高,并于处理后9 h达到最高值,为对照表达量的16.77倍;而MeJA处理对TwAP2/ERF2基因的表达表现出抑制作用,但于处理后48 h相对表达量有所提高。研究表明,雷公藤TwAP2/ERF1转录因子响应MeJA早期诱导正调控,推测其可能参与调控雷公藤植物次生代谢产物的生物合成,该研究结果为阐明雷公藤次生代谢物质的生物合成调控与利用现代生物技术提高雷公藤植物细胞中次生代谢物质的含量奠定了基础。
雷公藤鲨烯环氧酶基因克隆与表达分析
传书,,,陈蒙蒙,,,冯俊涛,,
- , 2018,
Abstract: 以雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)发状根为试验材料,采用RT PCR方法,克隆得到2个雷公藤鲨烯环氧酶编码基因,命名为TwSE1(GenBank登录号MG717395)和TwSE2(GenBank登录号MG717396)。序列分析表明,TwSE1和TwSE2的开放阅读框分别为1 578 和1 584 bp,分别编码525和527个氨基酸,2条序列相似性为76.18%,但N端序列不保守。实时荧光定量PCR检测雷公藤鲨烯环氧酶在不同组织部位的表达模式,以及雷公藤发状根受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后基因表达的结果表明,TwSE1、TwSE2基因在雷公藤根、茎、嫩叶、老叶、花中均有表达,TwSE1在花中表达丰度最高,在根中表达丰度最低;但TwSE2在花和嫩叶中表达量最高,在老叶中表达量最低,且TwSE2在各组织部位的表达量都低于TwSE1。雷公藤发状根经MeJA诱导后,TwSE1、TwSE2基因表达量均上升,都表现为表达量先上升后下降再上升的趋势,并于诱导后3 h达到一个高水平表达,之后下降,在诱导12 h后表达量又迅速上升;在相同诱导条件下,TwSE2基因表达水平的提高小于TwSE1基因。
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