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分泌高效蛋白的地衣芽孢杆菌及其工业应用
牛丹丹,贵阳,王正祥
生物技术通报 , 2009,
Abstract: 革兰氏阳性、腐生性地衣芽孢杆菌是高温α-淀粉酶、碱性蛋白酶的重要工业生产用菌株。其基因组大小约为4.22Mb,已被多个国际机构认定为GRAS工业菌株。地衣芽孢杆菌具有完善的蛋白分泌体系,蛋白合成与分泌能力可达到20~25mg/ml。在作为外源基因表达系统的研究中,建立了其遗传转化方法,完成了多种表达载体的构建与应用,以及进行了作为宿主细胞的地衣芽孢杆菌的遗传改良与多种重组蛋白表达的研究。显示地衣芽孢杆菌具有作为重组蛋白高效分泌表达的巨大潜力与工业应用价值。
苍白芽孢杆菌d-阿拉伯糖异构酶克隆表达及d-塔格糖制备
张娥,张梁,贵阳
食品科学 , 2013,
Abstract: ?目的:利用筛选出的一株能产d-阿拉伯糖异构酶(d-ai)的耐热菌株,将d-半乳糖转化为d-塔格糖。方法:从实验室保藏的菌株中筛选出一个产d-阿拉伯糖异构酶能力较强的苍白芽孢杆菌,将该菌株中的d-阿拉伯糖异构酶基因d-ai克隆到载体pet-28a上,并转化到大肠杆菌bl21(de3)中表达。通过sds-page分析发现,重组菌株能表达出大量可溶性蛋白。结果:d-阿拉伯糖异构酶纯化酶的最适反应ph值和温度分别是7.0和60℃,在ph6.0~8.0范围和30~70℃范围内具有较好的稳定性。加入mn2+、zn2+、fe2+、ca2+和ba2+均能够使d-塔格糖的转化率提高,而mg2+和cu2+则对酶活力产生不同程度的抑制。结果表明:底物质量浓度为18g/l的d-半乳糖(含5mmol/lmn2+),加入到ph值为7.0的重组细胞粗酶液中,在60℃条件下反应12h,可达到最高转化率为41.6%。结论:这表明具有生物活性的重组d-ai在大肠杆菌e.coli(bl21)中成功表达且具备工业化生产d-塔格糖的潜能。
通过同源介导a-淀粉酶基因扩增改良地衣芽孢杆菌a-淀粉酶生产菌株
牛丹丹?,贵阳,王正祥?
生物工程学报 , 2009,
Abstract: 地衣芽孢杆菌高温a-淀粉酶(bla)是淀粉水解与生物加工过程中重要关键酶制剂之一。为了进一步提高地衣芽孢杆菌高温a-淀粉酶生产菌株的生产性能,本研究构建了一种含有地衣芽孢杆菌高温a-淀粉酶编码基因amyl的整合性重组质粒pbl-amyl。将重组质粒pbl-amyl转化入bla工业生产菌株bacilluslicheniformisb0204,再在卡那霉素存在下介导其b.licheniformisb0204染色体中的同源整合与高温a-淀粉酶编码基因amyl的扩增,由此获得了携带多个amyl拷贝的转化子。对转化子的amyl拷贝数及其bla发酵水平分别用荧光实时定量pcr及摇瓶发酵试验进行评价与鉴定。与出发菌株b0204相比,含2~5倍amyl拷贝数的重组菌的bla的合成水平显著提高。其中,重组菌rebl18生产bla的水平提高了89.2%。
过表达nadh激酶基因对酿酒酵母乙醇发酵的影响
王寒?,张梁?,贵阳
生物工程学报 , 2014, DOI: 10.13345/j.cjb.130547
Abstract: 甘油是酿酒酵母乙醇代谢途径中的主要副产物,降低甘油生成,可以提高乙醇的产率和原料的利用率。以工业酒精酵母单倍体s1(mata)为研究对象,构建了一个4.5kb左右的基因敲除突变盒gpd2δ::pgk1pt-pos5-hybr,利用醋酸锂转化法转入s1,得到重组菌s3(gpd2δ::pgk1pt-pos5-hybr),使得工业酒精酵母在敲除gpd2的同时整合过表达了nadh激酶基因pos5。结果表明,在150g/l的葡萄糖摇瓶发酵实验中,重组菌s3在不影响菌株生理特性的条件下,乙醇得率(gethanol/gglucose)比原始菌株s1提高了8%,甘油得率(gglycerol/gglucose)降低了33.64%。本研究证明过表达nadh激酶基因可降低乙醇发酵中副产物甘油的生成并提高乙醇得率。
酿酒酵母gpd1中整合表达纤维二糖酶基因用于纤维素酒精发酵的研究
张 梁?,贵阳,王正祥?
西北农林科技大学学报(自然科学版) , 2006,
Abstract: 采用基因敲除技术,作工业酿酒酵母染色体dna上的甘油代谢途径关键酶基因gpd1中,整合入来源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因荩bglⅱ.通过提高g418浓度筛选得到多拷贝整合子。结果表明,融合子利用纤维二精的能力得到提高,产甘油能力下降,外源基闪表达稳定;引入外源基因后.其对酵母增殖能力没有大的影响,仅形态发生变化;在以微晶纤维素为原料,结合纤维素酶发酵时,与亲代工业酿酒酵母相比,发酵液乙醇浓度最高增加69%。
外环流式发酵罐用于玉米生料酒精发酵的研究
贵阳,马文超?,张 梁?
西北农林科技大学学报(自然科学版) , 2005,
Abstract: 对玉米粉悬浮液沉降情况的研究表明,沉降界面初始沉降速度随初始浓度的增加而减小。对外环流式发酵罐用于玉米生料酒精发酵进行研究,结果表明,起始阶段,玉米粉悬浮液要在外环流式发酵罐中完成强制回流循环,必然存在一个最小回流量q;通过恒流泵强制发酵醪循环可以显著缓解原料沉淀造成的不利影响,有利于发酵罐中的传质;发酵20h,强制循环发酵液中酵母细胞出芽率较自然发酵提高84.8%,死亡率降低100%,发酵70h时酒精度提高11.5%;采用外环流式发酵罐进行玉米生料发酵酒精时,较大的高径比对发酵有利。
在GPD1中整合表达蜜二糖酶基因改善酒精发酵水平*
贵阳,张梁,章克昌,王正祥
微生物学通报 , 2005,
Abstract: 依据同源重组的原理将来源于粟酒裂殖酵母的α-半乳糖苷酶基因m el整合到工业酿酒酵母染色体的甘油合成途径关键酶基因GPD1中,通过G418抗性筛选得到重组子。实验数据表明,重组子S.cerevisiaeMG1利用蜜二糖的能力显著提高,产甘油能力下降。引入外源基因后酵母性状与亲代相比没有显著差异,但生长时具自絮凝能力。MG1分别以玉米粉、小麦淀粉为原料进行浓醪酒精发酵,与亲代工业酿酒酵母比较,发酵液乙醇浓度得到提高,甘油含量降低,蜜二糖消耗殆尽。
利用26SrDNAD1/D2区序列和微卫星标记分析各种工业酿酒酵母的种内遗传差异
铁春燕,胡芸,张梁,贵阳
菌物学报 , 2014, DOI: 10.13346/j.mycosystema.130054
Abstract: 选取30株传统发酵工业中不同来源的酿酒酵母菌株和实验室常用酿酒酵母菌株,利用大亚基(26S)rDNAD1/D2区序列和微卫星标记分析酿酒酵母种内菌株间的遗传多样性和系统发育关系,以揭示酿酒酵母在长期的各种工业发酵环境下发生的遗传变异。结果表明:30株酿酒酵母的26SrDNAD1/D2区序列(591bp)比较保守,与测序菌株S288C相比序列相似度在99.8%–100%,说明种内菌株间存在一定的多态性,但序列差异并不十分明显,其变异情况表现在个别碱基的差异(大多由转换突变引起);通过扩增11个微卫星位点,每个菌株均有其独特的基因型,即30种基因型,共得到188个等位基因,观测杂合度平均值和期望杂合度平均值分别为0.576、0.886,多态信息含量平均值高达0.858,说明酿酒酵母种内菌株间具有较高的遗传多样性,而聚类分析表明30株酿酒酵母可以得到很好地区分,但是没有呈现与其工业来源相关的聚类。
根癌土壤杆菌产辅酶Q10的补料分批发酵工艺
金赛,徐俭,张梁,丁重阳,贵阳
过程工程学报 , 2011,
Abstract: 以根癌土壤杆菌(AgrobacteriumtumefaciensQ14)为生产菌株,在15L发酵罐内对补料分批发酵生产辅酶Q10的工艺进行优化.通过逐步添加限制性营养物质,考察其对发酵的影响,获得了较优的补料分批发酵工艺,即流加葡萄糖和KH2PO4溶液,将葡萄糖和磷浓度分别控制在5~15g/L和50~120mmol/L,同时,在30和50h各加入5%(j)新鲜发酵培养基.在此工艺条件下,发酵周期为84h,菌体量达87.2g/L,辅酶Q10产量高达2166.2mg/L,生产强度为25.8mg/(L×h),比分批发酵提高了7.8倍.
解淀粉芽孢杆菌BamHI甲基转移酶基因克隆、功能鉴定与序列分析
刘洋,沈微,贵阳,王正祥
生物技术通报 , 2009,
Abstract: 从解淀粉芽孢杆菌BaillusamyloliquefaciensCICIMB2125中克隆了BamHI甲基转移酶基因(bamHIM),并在大肠杆菌JM109中得到了成功表达。该基因含有1271bp的开放阅读框(ORF),编码423个氨基酸,成熟蛋白分子量为49kD。该基因在自身启动子引导下,表达了具有活性的BamHI甲基转移酶(M.BamHI)。该酶可以将BamHI位点的碱基甲基化。氨基酸序列分析表明该酶存在有NADB_Rossmann结构域。
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