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高尔基体基质蛋白130、14-3-3ζ、整合素α3在中、低分化胃癌组织的表达及意义
陈 婕,牟 玲,
重庆医科大学学报 , 2014,
Abstract: 目的:检测高尔基体基质蛋白130(Golgimatrixprotein130,GM130)、14-3-3zeta(14-3-3ζ)、整合素α3(integrinal-pha3,Integrinα3)在正常胃组织和中、低分化胃癌组织中的表达,并由此探讨其与胃癌的关系。方法:运用免疫组织化学检测(streptavidin-biotincomplex,SABC)法分别检测临床收集的84例胃癌患者的胃癌组织和正常胃组织(距癌肿边缘5cm以上的胃组织)GM130、14-3-3ζ、Integrinα3的表达情况,并结合临床病理资料进行分析;用RT-PCR和Westernblot分别检测42例胃癌(低分化胃癌24例,中分化胃癌18例)和42例正常胃组织GM130、14-3-3ζ、Integrinα3的mRNA和蛋白表达情况。结果:(1)GM1301、14-3-3ζ2、Integrinα33在胃癌组织中的表达阳性率分别为88.1%、90.5%、95.2%,明显高于上述各指标在正常胃组织上的阳性表达率(52.4%、27.4%、42.9%);低分化胃癌组上述3个指标的表达较中分化胃癌组高,且2组间差异有统计学意义(P1=0.000、P2=0.007、P3=0.000)。Spearman等级相关性分析显示,胃癌中GM130、14-3-3ζ、Integrinα3之间表达呈两两正相关(P<0.05)。(2)GM130、14-3-3ζ、Integrinα3的表达均与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径、肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移无关(P>0.05);而与肿瘤病理组织学分级及临床分期有关(P<0.05)。(3)RT-PCR及Westernblot结果显示GM130、14-3-3ζ、Integrinα3mRNA和蛋白质的表达在胃癌组较正常胃组织组高,低分化胃癌组较中和分化胃癌组高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:GM130的异常表达可能在胃癌的发生发展中发挥重要作用。
MASPIN真核表达载体的构建及其对胃癌细胞株SGC7901增殖的影响
郑爱华,,周文文
第三军医大学学报 , 2009,
Abstract: 目的构建MASPIN真核表达载体,分析MASPIN过表达对胃腺癌细胞株SGC7901的影响。方法PCR扩增MASPIN基因全长,用载体PCR2.1构建重组质粒,转染至胃癌细胞株SGC7901。RT-PCR、Westernblot检测MASPIN基因表达变化,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪(FCM)分析细胞周期,观察过表达MASPIN对SGC7901细胞株的影响。结果成功构建MASPIN/PCR2.1表达载体并转染至胃癌细胞株SGC7901,转染上调了SGC7901细胞株MASPIN在mRNA、蛋白水平的表达。转染MASPIN的SGC7901细胞增殖率随时间而减慢,第24、48、72小时的细胞增殖率分别为93.07%、81.97%、66.5%,明显低于转染空载体组(95.98%、95.79%、95.59%,P<0.05)。与转染空载体组相比,过表达MASPIN的SGC7901细胞株在G0/G1期所占比例明显提高(70.3%vs55.6%),S期细胞减少(19.8%vs34.9%,P<0.05)。结论成功构建MASPIN/PCR2.1表达载体,过表达MASPIN可抑制SGC7901细胞株的增殖。
转染maspincDNA在胃癌细胞中的表达及其对uPA和uPAR表达的影响
周文文,,郑爱华
第三军医大学学报 , 2008,
Abstract: 目的研究转染maspincDNA在胃癌细胞中的表达及其对uPA和uPAR表达的影响,探讨maspin基因抑制胃癌浸润转移的机制。方法构建maspin/PCR2.1表达载体,转染胃癌细胞株MKN28和SGC7901,用RT-PCR和Westernblot检测maspin基因,uPA和uPAR表达的变化。结果经酶切证实,得到正向插入的真核表达质粒maspin/PCR2.1。成功转染到MKN28和SGC7901细胞中并表达,uPA和uPAR的mRNA和蛋白表达均降低。结论成功构建了maspin/PCR2.1表达载体,maspin基因可在靶细胞表达,并能抑制uPA和uPAR的表达。
过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ对胃癌细胞株BGC-823增殖的影响
杨紫汐,,杨雅莹
第三军医大学学报 , 2012,
Abstract: 目的探讨过表达高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)对人胃癌细胞株BGC-823增殖活性的影响。方法构建真核表达载体EX-E2372-M03,通过脂质体Lipofectamine2000转染至人胃癌细胞株BGC-823,筛选稳定细胞株,用免疫荧光观察转染效率。用RT-PCR法检测转染细胞GMⅡ、c-myc、bcl-2mRNA的表达,用Westernblot法检测转染细胞GMⅡ、c-myc、bcl-2蛋白表达的变化,用MTT法及流式细胞仪检测过表达GMⅡ后对细胞增殖活性的影响。结果GMⅡ真核表达质粒构建成功并成功转染,MTT结果示过表达GMⅡ后胃癌细胞增殖活性明显高于对照组(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比较,GMⅡ过表达组胃癌细胞G1期细胞明显减少,S期细胞比例明显增加。转染后胃癌细胞GMⅡmRNA和蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05),且可明显上调胃癌细胞BGC-823中c-myc的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),但对bcl-2的调节作用不明显。结论过表达GMⅡ能促进胃癌细胞增殖,可能与上调c-myc的表达有关。
胃癌细胞高尔基体的蛋白质组学技术平台的建立
何婷婷,**,李艳青,肖钟
中国生物工程杂志 , 2010,
Abstract: 采用蔗糖密度梯度超速离心法分离纯化高尔基体,双向凝胶电泳(2-de)分离高尔基体蛋白质,用imagemaster2d软件分析所得图谱,基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(maldi—tofms)鉴定蛋白质点等一系列亚细胞器蛋白质组学方法建立胃癌细胞内高尔基体的蛋白图谱。结果显示分离出的纯度较高的高尔基体建立了分辨率和重复性均较好的双向电泳图谱,运用质谱技术鉴定出12个蛋白质,包括蛋白合成相关蛋白、膜融合蛋白、调节蛋白、凋亡相关蛋白、运输蛋白、细胞增殖分化相关蛋白。通过亚细胞器分离纯化,双向电泳的蛋白分离及maldi-tofms蛋白鉴定分析,首次成功建立了胃癌细胞sgc7901中高尔基体的蛋白质组学技术路线,为胃癌细胞内高尔基体功能的深入研究奠定了基础。
火菇素的圆二色性与溶液二级结构
,张长铠,陈雅丽,,
化学学报 , 2000,
Abstract: 为了弄清火菇素蛋白的结构与功能的关系并揭示抗癌机理,使其更好地发挥临床作用,测定了火菇素的圆二色性,并用蛋白质二级结构解析程序分析了火菇素的溶液二级结构。火菇素远紫外圆二色性的研究表明,其水溶液在208nm处表现为宽大负峰,最大平均残基摩尔椭圆度[θ]~2~0~8=-6574deg·cm^2·dmol^-^1,在223nm处为肩,经二级结构解析程序计算分析,火菇素的二级结构和二硫键和芳香氨基酸对火菇素圆二色性的贡献分别为77.4%和22.6%,二级结构的组成为α-螺旋19.7%,β-折叠和β-转角50.1%,无规卷曲和γ-转角30.2%。火菇素二级结构对pH,SDS和乙醇有一定的稳定性,在pH4.6~9.4范围内,火菇素的结构几乎不发生变化,但在碱性太强的环境中火菇素发生不可逆变性,火菇素对热变性很敏感。
shRNA抑制高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ基因的表达对胃癌细胞侵袭力的影响及机制
张 璐,杨雅莹,黄子洋,
重庆医科大学学报 , 2014,
Abstract: 目的:初步分析高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgialpha-mannosidaseⅡ,GMⅡ)在低中不同分化人胃癌细胞系中的差异表达,以探讨GMⅡ在胃癌发生发展中的作用。方法:应用阳离子脂质体法将合成的靶向GMⅡ基因的pGPU6/GFP/Neo-GMⅡ-1406质粒载体,分别转染至低分化胃癌细胞MGC-803和中分化胃癌细胞SGC-7901中,然后荧光倒置显微镜观察并计算转染率,最后经过G418筛选出稳定转染的细胞株。应用RT-PCR和Westernblot检测转染后GMⅡ和E-cadherin、α-catenin的mRNA及蛋白表达变化情况,同时利用细胞划痕实验和Transwell体外侵袭实验来测定GMⅡ被沉默后两株细胞侵袭能力的变化。结果:GMⅡ短发卡RNA(shorthairpinRNA,shRNA)转染胃癌MGC-803和SGC-7901细胞后GMⅡ的mRNA和蛋白表达明显抑制,而E-cadherin和α-catenin的2种因子检测结果明显升高(P<0.05);细胞划痕实验结果显示,转染重组质粒pGPU6/GFP/Neo-GMⅡ-1406组(GMⅡshRNA组)与对照组(空白对照组,阴性对照组)相比,GMⅡ被沉默后的胃癌细胞的侵袭能力降低(P<0.05);Transwell体外侵袭实验中GMⅡshRNA组胃癌细胞较空白对照组、阴性对照组细胞侵袭能力都明显降低,18h穿过小室的细胞数分别为:(65±5)、(197±6)、(186±5),(72±4)、(178±4)、(184±5)个与对照组相比差别具有统计学意义(MGC-803:P=0.000,SGC-7901:P=0.000)。结论:GMⅡ基因沉默后的胃癌细胞的侵袭能力下降,可能与上调E-cadherin、α-catenin的表达有关。
抑制GM130表达对胃癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响
冯阳阳,陈婕,牟玲,苏琳茜,
第三军医大学学报 , 2015,
Abstract: 目的分析GM130在不同分化人胃癌细胞系的差异表达,利用小干扰RNA技术来沉默GM130基因,研究其对胃癌细胞生物学行为的影响。方法体外培养3株不同分化程度胃癌细胞系(高分化MKN-28、中分化SGC-7901、低分化MKN-45),Westernblot和RT-PCR筛选出高表达的GM130细胞株MKN-45、SGC-7901,设计并化学合成、转染、筛选出针对GM130的小干扰RNA片段。通过MTT、Transwell、Matrigel侵袭实验,观测下调GM130后对胃癌细胞株的生物学行为影响,Westernblot检测细胞中MMP-2、MMP-9蛋白的变化。结果Westernblot和RT-PCR检测结果显示,在MKN-45、SGC-7901细胞中GM130蛋白和mRNA水平呈现高表达水平。Westernblot和qRT-PCR结果显示在低分化胃癌MKN-45细胞中,GM130-siRNA-519转染组GM130基因的表达水平显著抑制(P<0.05)。与对照组相比,抑制转染组细胞的增殖、迁移能力明显下降,穿膜细胞数明显减少,MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论抑制GM130基因的表达下调可显著降低胃癌细胞的增殖和体外侵袭转移能力。
shRNA抑制p115表达对胃癌体外血管形成的影响
文雪,,邓玮,屈玉玲,闫田静
第三军医大学学报 , 2011,
Abstract: 目的初步探讨胃癌BGC-823细胞高尔基体囊泡转运蛋白(golgi-vesiculartransportprotein,p115)对胃癌血管形成的影响及其可能机制。方法采用脂质体介导法将p115shRNA-1318转染入胃癌BGC-823细胞株,经G418筛选出稳定转染的细胞株。利用Westernblot、RT-PCR和细胞免疫荧光方法检测转染后的p115抑制效应及其对MIF、p-Akt、VEGF-A的调控情况;采用细胞活性检测实验、Transwell体外侵袭实验和血管形成实验方法分别检测转染p115shRNA的胃癌BGC-823细胞对人脐静脉血管内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs)增殖,迁移和血管形成的影响。结果p115shRNA-1318转染后胃癌BGC-823细胞p115、MIF、p-Akt和VEGF-A的蛋白及mRNA表达明显抑制(P<0.01);细胞免疫荧光:与对照组相比,p115shRNA组p115、MIF及VEGF-A的色泽暗红且抑制率分别为63%、65%、68%;细胞活性检测:与对照组相比,p115shRNA组HUVECs增殖能力明显降低(P<0.05);Transwell侵袭实验:p115shRNA组HUVECs较空白对照组,阴性对照组(shNC)细胞侵袭能力明显降低,24h穿过Transwell的细胞数分别为:(39±5)、(174±4)、(179±4),与对照组相比差别具有统计学意义(P<0.05);血管形成实验:p115shRNA组HUVECs不能在Matrigel胶上形成网状结构,空白对照组、shNC组成管指数分别为:(1289±37)、(1329±33),p115shRNA组成管指数为:(422±41),与对照组相比差别具有统计学意义(P<0.05)。结论p115基因沉默下调胃癌的VEGF-A表达及抑制血管生成;其分子机制可能与MIF通过PI3K/Akt信号通路途径调节胃癌血管形成有关。
MUC2反义核酸对胃癌细胞蛋白水解酶表达的影响
罗文军,,张晓艳,林晓
第三军医大学学报 , 2007,
Abstract: 目的探讨MUC2反义脱氧寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide,ASODN)抑制人胃癌细胞株SGC7901黏蛋白MUC2的表达及其对癌细胞蛋白水解酶表达的影响。方法采用脂质体作为载体,将载体与MUC2基因的串联重复区互补,经硫代磷酸修饰的反义寡核苷酸(ASODN)导入MUC2蛋白高表达的胃癌细胞株SGC7901,采用RT-PCR、流式细胞仪、免疫组织化学等方法检测MUC2ASODN对胃癌细胞凋亡和蛋白水解酶的表达。结果RT-PCR结果显示,SGC7901细胞转染MUC2ASODN48h后,MUC2的mRNA表达与对照组相比明显降低(P<0.01)。流式细胞仪分析MUC2ASODN处理SGC7901细胞48h后,G0G1期细胞百分比下降,S期细胞百分比明显增加,且能诱导细胞凋亡,凋亡细胞占4.38%,与对照组比较(P<0.01)。免疫组化S-P法检测转染MUC2ASODN胃癌细胞、组织蛋白酶D、MMP-2表达显著下降(P<0.05)。结论MUC2可促进癌细胞产生蛋白水解酶,使用人工合成MUC2ASODN在体外能有效抑制胃癌细胞株SGC7901蛋白水解酶的表达,并能诱导凋亡。
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