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矮牵牛f3,5h全长cdna的克隆及花特异启动子介导表达载体的构建
王 琳?,太和
热带亚热带植物学报 , 2009, DOI: 10.3969/j.issn.1005-3395.2009.4.2202
Abstract: 通过rt-pcr从蓝色矮牵牛(petuniahybrida)花瓣中克隆类黄酮-3,5-羟基化酶基因(f3,5h)全长cdna(genbank登记号ef371021)。生物信息学分析表明克隆的f3,5h基因与genbank登记号d14588、z22545和dq352142等的f3,5h基因序列高度一致;其编码的氨基酸序列与genbank登记号baa03438.1(矮牵牛)、bac10997.1(银杯草)和aav85470.1(马铃薯)的高度同源,同源率分别为99%、88%和87%。利用pbin19、pbluescriptsk(+)和pmd18-pchsa质粒成功构建了花特异性启动子pchsa驱动的f3,5h基因的表达载体pbin19-pchsa-f35h,并导入到野生型发根农杆菌k599中。利用k599诱导菊花生根,不定根的诱导率可达30.7%。这为利用转基因技术创造蓝色花卉提供了重要的基础。
黄瓜多抗自交系nc-46转基因不定根的高频诱导及其cdna文库的构建
孟莎莎,太和,王琳
园艺学报 , 2010,
Abstract: 利用发根农杆菌k599(带有质粒pbin-35s-gfp),以具有抗爪哇根结线虫和花生根结线虫等多种抗性基因的黄瓜自交系nc-46离体子叶为外植体,高效诱导出转基因不定根(诱导率达76.7%);并在此基础上成功构建了转基因不定根的cdna文库。构建的cdna文库重组率为98.3%,原始库容量达2.02×106cfu,其中基因的完整性比率为47.6%,unigene比例为66.7%。选用转基因不定根构建根的cdna文库,克服了实生苗难以获得大量均一状态根的缺陷;克服了实生苗根受到土壤根际微生物、线虫等对根生理状态的影响以及对提取rna的污染问题;利用改良的smartcdna文库构建法,获得的文库克隆含有完整的5′端非翻译区的全长cdna;此外,构建的文库由于利用改良的puc19载体替代了λtripiex2噬菌体载体,获得的克隆无需再将插入到噬菌体载体上的cdna转染到质粒载体,可直接用于杂交和测序筛选,因此在基因克隆筛选时更加方便。
发根农杆菌k599对菊花活体转化及其高效再生
太和,王琳,蒋欢,田璟鸾
园艺学报 , 2011,
Abstract: 发根农杆菌k599侵染菊花无菌苗刻伤的叶片形成转基因不定根,生根频率为88.0%;不定根经过诱导培养形成愈伤组织,并再生完整植株,愈伤组织诱导率和分化率分别为75.0%和63.3%。诱导的不定根和再生植株经过pcr鉴定含有k599ri质粒中的rolc基因,qrt-pcr检测显示rolc基因在再生转基因植株中实现了正常表达。再生植株表现出矮缩、多毛状根特征,并能正常开花。建立的利用活体材料直接作为发根农杆菌k599侵染的受体诱导不定根的遗传转化体系,能克服假阳性不定根的出现;同时,利用不定根繁殖过程中顶端生长点区域无菌的特点,通过截取不定根顶端靠近生长点区域进行继代培养,结合使用头孢霉素杀菌,能达到有效抑制和杀灭农杆菌的目的,在随后的不定根诱导愈伤及分化过程中无须再使用抗生素杀菌,提高了转基因再生效率,为菊花的矮化育种和目标基因的转移提供了良好的试验体系。  
矮牵牛中查尔酮合成酶基因a(chsa)2个启动子的克隆和分析
太和,徐纪明?,王琳?,林磊?
生物化学与生物物理进展 , 2011,
Abstract: 查尔酮合成酶(chalconesynthase,chs)是类黄酮类物质生物合成途径中的第一个关键酶,其控制基因chs为超家族基因.根据前人报道的矮牵牛查尔酮合成酶基因a(chsa)启动子的保守序列设计1对特异性引物,从矮牵牛基因组dna中通过1次pcr同时扩增出长为550bp和354bp的启动子(分别命名为pchsa-l和pchsa-s,genbank登录号:ef199747和ef199748),其中pchsa-l与pchsa-s相比,除个别碱基有差异外,在88~269bp多出一段182bp的序列,其中103~201bp含有典型的内含子特征.应用dnastar软件分析表明2条序列均含有普通启动子的保守序列tatabox、ccaatbox、capsite(ccataa),并含有花中特异表达启动子的特征序列tacpyatbox、antherbox(tagaagtgacagaaat)、g-box(cacgtg)、box1元件(atgtcacgtgccatc)和box2元件(tgtgttgaaggtttgcta).对克隆启动子所用的矮牵牛后代群体进行分析,130个单株中只含有pchsa-s的有13株,只含有pchsa-l的有20株,同时含有2个启动子的有97株.2个启动子在后代中发生了分离,但其分离比并不符合1∶2∶1.克隆启动子所用的矮牵牛有14条染色体,为二倍体.dna印迹表明2个启动子在基因组中均是多拷贝.qrt-pcr分析显示:未经过紫外光处理的花中以及经过紫外光处理的花中,pchsa-l启动子驱动的chsa基因与pchsa-s启动子驱动的chsa基因表达都未见明显差异;在紫外光处理的幼苗叶片中表达量相应地比紫外光处理的花中的表达量增高;在紫外光处理的幼苗叶片中,pchsa-l启动子驱动的chsa基因比pchsa-s启动子驱动的chsa基因表达量显著增高;而未经过紫外光处理的幼苗叶片中,pchsa-l启动子驱动的chsa基因、pchsa-s启动子驱动的chsa基因都没有检测到明显的表达信号.结果表明:在矮牵牛中chsa基因存在2个独立的启动子pchsa-l和pchsa-s;启动子pchsa-l中182bp类内含子特征的序列具有显著提高chsa基因在紫外光处理的幼苗叶片中表达量的功能.
Construction of a novel vector harboring green fluorescence protein gene (gfp) and high expression of gfp in transformed roots of Petunia hybrida
含gfp植物转基因表达载体的构建及在矮牵牛转基因不定根中的高效表达

XU Ji-Ming,XIANG Tai-He,
徐纪明
,太和

遗传 , 2008,
Abstract: A novel vector pBIN-35S-GFP was constructed from the plasmids of pBIN19, pGFP, and pCHS, which included gfp gene driven by the CaMV 35S promoter. The hairy roots of Petunia hybrida were induced by wild-type Agrobacterium rhizogenes K599 harboring pBIN-35S-GFP with the frequency of 45%. The PCR results showed that rolB from K599 Ri plasmid and gfp from pBIN-35S-GFP were co-transformed into the genome of P. hybrida. The high activity of green fluo-rescence protein was detected by fluorescence microscopy. In particularly, the vector carries multiple cloning sites at both 5' and 3' of the CaMV 35S promoter, which allows easy exchange 35S promoter to study other promoter functions. In addition, there are multiple cloning sites at 5' end and one-sites of EcoRand Bsmsites at 3' end of gfp. Therefore, it supports to fusion target genes to expression fusion protein and can be replaced with any other genes of interest for genetic transforma-tion.
长期培养的黄瓜毛状根中外源基因遗传稳定性分析
曹庆丰,太和*,孟莎莎,王沙沙,陆文怡
园艺学报 , 2012,
Abstract: 对在固体培养基上培养3年的黄瓜转gfp基因毛状根进行gfp和rol位点系列基因的pcr扩增、gfp的荧光定量pcr、westernblot杂交以及荧光观察分析。结果显示,由组成型启动子35s驱动的gfp在转录水平上能正常表达,而且能够翻译出编码蛋白;此外,培养3年后的毛状根,能扩增出与毛状根形态构成有关的rol系列基因。本研究结果表明长期培养的毛状根能保持其遗传稳定性,这为利用毛状根长期工厂化生产外源基因表达的蛋白产物和药用植物的活性成分提供了理论依据。
转哺乳动物cyp2e1基因矮牵牛耐甲醛胁迫的生理机制
王嫚,太和*,宋亚玲,黄盈盈,韩依萱,孙扬
园艺学报 , 2015, DOI: 10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0872
Abstract: 细胞色素p450cyp2e1酶主要存在于哺乳动物肝细胞中,在代谢异源有机物方面起着重要作用。前期研究发现,转cyp2e1矮牵牛显著提高了对甲醛的抗性。以转cyp2e1矮牵牛为试验材料,分析其对甲醛胁迫响应的相关生理指标。结果显示,在甲醛胁迫下,转cyp2e1矮牵牛细胞中的mda含量低于转gus和野生型矮牵牛,sod和pod活性均高于转gus和野生型,乙醇脱氢酶(adh)活性稍有增强,且消耗更多的谷胱甘肽。此外,在甲醛胁迫下,转cyp2e1矮牵牛的iaa、zrs和aba含量呈现下降而ga含量呈现上升趋势;但转gus和野生型矮牵牛iaa、zrs和aba含量呈现上升而ga含量呈现下降趋势。转cyp2e1矮牵牛在含有50mg?l-1甲醛的处理液中孵育72h后,处理液中甲醛含量接近为0;而转gus和野生型处理液中仍有近50%的甲醛。
高温高压含硫气井环空流体热膨胀带压机理
车争安,张智,太和,涂军军,,刘乃震
天然气工业 , 2010,
Abstract: ?在高温高压含硫气井中,环空带压值过大将会影响正常生产,一旦超过允许值将诱发潜在的安全事故。针对开采过程中井筒温度升高使密闭环空流体受热膨胀而导致的环空带压问题,建立了高温高压含硫气井环空流体热膨胀带压值的计算模型,并进行了实例计算。结果表明,高温高压含硫气井环空流体热膨胀引起的带压值很有可能会引起生产管柱的失效,给油气井安全生产带来威胁。因此,有必要在井身结构设计、套管强度设计与环空保护液优选时,根据油气井正常开采的工作制度,降低开采过程中环空带压值并开展有效的环空带压管理,确保高温高压含硫气井的长期安全生产。
不同性别类型黄瓜acc合酶基因的单核苷酸多态性标记和酶切扩增长度多态性标记
太和,王利琳?,庞基良?,胡江琴?,申屠连峰?,吴 锴?
生物化学与生物物理进展 , 2006,
Abstract: 黄瓜的性别分化与乙烯密切相关,1-氨基环丙烷-1-羧酸(acc)合酶是乙烯生物合成过程中的关键酶.根据acc合酶基因家族的保守序列设计pcr引物,从8个不同性别类型(雌雄同株、强雌性和全雌性)黄瓜品种中克隆了长度为1188bp的acc合酶基因(cs-acs2)片段(genbank登记号为:dq115884~dq115886和dq115875~dq115879).经测序分析,3个雌雄同株性别类型品种的序列完全相同.与之相比,5个强雌性和全雌性品种中存在8个单核苷酸多态性(snps)标记,snps标记为4个a←→g和4个t←→c之间的转换.在8个snps中,有1个snp位于内含子区域,其余7个snps都位于外显子区域.在7个位于外显子区域的snps中,有3个为非编码区的snps,4个为csnps.而在4个csnps中,有3个导致了编码的氨基酸序列改变.研究结果表明,与雌雄同株性别类型相比,雌性系中均存在单核苷酸的变异,这提示acc合酶基因cs-acs2的单核苷酸变异可能与黄瓜雌性系的发生形成有关.另一方面,根据snp多态性还发展了一个酶切扩增长度多态性(caps)标记c-mt700.利用caps标记c-mt700能将强雌性优良品种mt-705与其他黄瓜品种相区别,该标记在黄瓜育种生产上具有一定的应用价值.此外,研究获得的snps标记和caps标记丰富了黄瓜的分子标记种类.
转哺乳动物cyp2e1基因烟草植株再生及其分析
李佩菡?,太和,谢军?,冯婷?,陆文怡?
生物工程学报 , 2012,
Abstract: 哺乳动物肝细胞中cyp2e1基因所编码的蛋白cyp2e1在代谢异型有机物方面起着重要作用,转cyp2e1基因植物可以代谢多种小分子有机污染物;但cyp2e1基因在植物体内的表达调控和代谢机理尚不完全清楚。文中将含有cyp2e1基因的质粒psld50-6和对照gus基因的质粒pkh200转入根癌农杆菌gv3101,利用根癌农杆菌转基因技术将cyp2e1基因和对照gus基因成功转入烟草,分别获得了转cyp2e1和gus基因再生植株。选取pcr鉴定的再生植株进行荧光定量pcr(qrt-pcr)分析,结果表明:在转录水平上,转cyp2e1基因烟草中,乙醇处理后cyp2e1基因的表达明显下降,苯和甲苯处理后cyp2e1基因的表达量稍有下降;而丙酮、甲醛处理和缺氧条件下cyp2e1基因的表达有不同程度的升高。此外,苯处理后,转cyp2e1基因烟草中nadph-p450氧化还原酶和细胞色素b5酶的基因活性显著提高,说明烟草中nadph-p450氧化还原酶和细胞色素b5酶与cyp2e1酶的解毒过程有关,可能起到哺乳动物体内的nadph-p450氧化还原酶和细胞色素b5的功能,参与cyp2e1酶催化过程的电子传递链。
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