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Estudo comparativo de três diferentes procedimentos para extra??o de RNA a partir de amostras fixadas em formalina e embebidas em parafina
Ribeiro-Silva, Alfredo;Garcia, Sérgio Britto;
Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial , 2008, DOI: 10.1590/S1676-24442008000200009
Abstract: background: the development of methods for rna extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (ffpe) samples has allowed retrospective studies of molecular biology. objectives: to compare the quantity and quality of rna extracted from ffpe samples using three commercially available kits. material and methods: using three different procedures, the total rna was extracted from 14 paraffin blocks containing fragments of mammary carcinomas, which had been archived for 10 years. the quantity of rna was expressed in pg/μl; and the quality in rna integrity number (rin), by using the agilent bioanalyser with pico labchip. the rna with higher rin extracted from each of the 14 samples was amplified by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (rt-pcr) using the g6pd gene with primers designed to create fragments with 67, 151 and 242 base pairs (bp). results: the mean and median of rna quantity extracted for the three procedures were respectively 42.91 and 31.31 pg/μl. the mean and median of rin were respectively 1.8 and 2. in all the samples, the g6pd gene was amplified for rna fragments with 67 and 151 bp. discussion: due to the significant individual variation in quantity and quality of the extracted rna from each sample, the data from the present study show that, if it is not possible to extract rna from a given sample in the first attempt, a second extraction should be performed before excluding this sample. conclusion: it was possible to extract rna with acceptable quality for amplification by rt-pcr (rin > 1.4) in the three procedures used.
Padroniza??o da técnica de imuno-histoquímica para raiva em amostras de tecido do sistema nervoso central de bovinos fixadas em formol e emblocadas em parafina
Pedroso, Pedro M.O.;Pescador, Caroline A.;Bandarra, Paulo M.;Raymundo, Djeison L.;Borba, Mauro R.;Wouters, Flademir;Bezerra Júnior, Pedro S.;Driemeier, David;
Pesquisa Veterinária Brasileira , 2008, DOI: 10.1590/S0100-736X2008001200012
Abstract: for standardization of the rabies immunohistochemistry technique, five samples of central nervous system (cns) of cattle naturally infected with rabies virus were examined. one polyclonal antibody and two monoclonal antibodies were used. the following reagents were evaluated for antigen retrieval: xiv protease, proteinase k and citrate buffer (ph 6.0) boiling at 100oc during 15 minutes in bain-marie. detection of rabic antigen was possible with the three antibodies tested. the polyclonal antibody was superior to the monoclonal antibodies, demonstrating good results with the three antigen retrieval protocols. the highest intensity staining was obtained with the citrate buffer and heat. the immunohistochemistry technique demonstrated the presence of viral antigens in the cytoplasm of neurons, in form of aggregates or with round or oval shape. the antigens were found as single or multiples inclusion bodies in the neurons. immunohistochemistry is a fast method that can be used in routine procedures in cases where rabies is suspected, especially when the brain is submitted to the laboratory as formalin-fixed fragments or when samples could not be immediately shipped. the technique is also useful for retrospective studies.
Identifica o imuno-histoquímica de Listeria monocytogenes em placentas fixadas em formol e embebidas em parafina
Schwab Jussara Pires,Edelweiss Maria Isabel Albano
Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia , 2003,
Abstract: OBJETIVOS: identificar Listeria monocytogenes (Lm) em placentas humanas pela técnica de imuno-histoquímica (IHQ) e relacionar sua presen a com as altera es histológicas encontradas com as altera es histológicas encontradas no exame convencional, com o trimestre gestacional, a idade das gestantes, casos de aborto e parto prematuro e a ocorrência de aborto habitual. MéTODOS: um estudo retrospectivo foi realizado no setor de patologia de um hospital-escola de Porto Alegre no ano 2000. O material dos blocos de parafina de 254 placentas (exames anatomopatológicos), provenientes de aborto, de parto prematuro e de nascimento a termo, foi analisado pela técnica histológica convencional com a colora o de hematoxilina e eosina (HE). A técnica de IHQ foi realizada no material de 148 exames anatomopatológicos, que apresentaram altera es inflamatórias, hemorragia, necrose e trombose, utilizando anticorpo policlonal Rabbit A "Listeria monocytogenes" B65420R (Biodesign ) na dilui o 1:1000 e complexo avidina-biotina-estreptavidina. O teste c2 foi aplicado para a análise estatística. RESULTADOS: a presen a de Lm foi identificada em 33,7% das placentas analisadas pela técnica IHQ. Corioamnionite e vilite foram as altera es inflamatórias que estiverem associadas a diferen a significativa nas placentas positivas. Lm esteve presente nas placentas de 1o, 2o e 3o trimestre gestacional. N o houve associa o entre idade das gestantes, casos de aborto e/ou parto prematuro e a presen a ou ausência de Lm nas placentas. Abortos habituais ocorreram em pacientes com ou sem Lm no tecido placentário. CONCLUS O: a técnica de IHQ pode ser utilizada para confirmar o diagnóstico histopatológico de listeriose em todos os trimestres gestacionais.
Evaluación de dos métodos de extracción de ADN a partir de biopsias fijadas en formalina y embebidas en parafina en condiciones no optimas  [cached]
Bustamante Javier Andres,Astudillo Miryam,Pazos Moncayo Alvaro Jairo,Bravo Luis Eduardo
Acta Biológica Colombiana , 2011,
Abstract: Los tejidos de archivo son un material de incalculable valor para estudios retrospectivos que requieran la aplicación de análisis moleculares. Existen múltiples métodos de extracción de ADN a partir de este tipo de muestras. No obstante, la mayoría de métodos toman mucho tiempo y los reactivos empleados contribuyen a la fragmentación del ADN. Con el objetivo de optimizar dos métodos de extracción de ADN a partir de tejidos embebidos en parafina en condiciones no optimas. Se seleccionaron 47 bloques en parafina que contenían biopsias de pleura, pulmón y pericardio correspondientes a 24 pacientes (66,66%hombres) mayores de 18 a os, con inflamación granulomatosa crónica, remitidos al Departamento de Patología del Hospital Universitario del Valle entre 2002-2007. A cada muestra se le realizaron 10 cortes y se sometieron a dos métodos de extracción de ADN: 1.Convencional y 2.QIAamp-DNA mini kit . La eficiencia del ADN fue valorada por espectrofotometría y amplificación del gen GAPDH. La concentración de ADN de las muestras extraídas por el método convencional fue de 65.52ng/μl ±11.47 (promedio±EE) y la relación 260/280 vario entre 0.52 y 2.30. De las muestras extraídas por el método comercial, la concentración media de ADN fue 60.89ng/μl±6.02, con una absorbancia que oscilo entre 0 y 2.64. El ADN obtenido fue sometido a PCR, de 47 muestras extraídas por ambos métodos, 25 y 23 respectivamente amplificarón exitosamente el gen GAPDH. Los métodos usados para la obtención de ADN presentaron un desempe o similar, revelando así su potencial utilidad en estudios retrospectivos a partir de biopsias embebidas en parafina en condiciones inadecuadas.
Influenza aviar: histopatología y detección viral por RT-PCR en tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina  [cached]
Roberto Padilla Noriega,Enrique Aburto Fernández,Moisés Fraire Cachón,Luis Padilla Noriega
Veterinaria México , 2004,
Abstract: Se estableció la técnica de transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para la detección del virus de influenza aviar en tejidos de aves infectadas experimentalmente, incluidos en parafina, lo cual se correlacionó con las lesiones histológicas. Se inocularon por vía intravenosa ocho equilotes de diez pollos Arbor Acres de cinco semanas de edad, con 101 a 108 dosis letales de pollo del 50% (DLP50) del virus de influenza aviar A/Ck/Querétaro/20/95 (H5N2). Todas las aves se sometieron a evaluación histopatológica. Se ensayaron por RT-PCR tres tipos de tejidos incluidos en parafina (un ave por dosis): pulmón, encéfalo y ri ón. Las principales lesiones histológicas observadas en las aves infectadas incluyeron necrosis del tejido linfoide (en pulmón, bazo, bolsa de Fabricio y tonsilas cecales), vasculitis, necrosis tubular aguda, encefalitis no supurativa y necrosis multifocal en los órganos examinados. Las principales diferencias con otras cepas altamente patogénicas ?peste de las aves (H7N7), Ck/Scot/59 (H5N1), Tern/SA (H5N3), Ty/Ont/66 (H5N9) y Ck/Penn/83 (H5N2)? fueron: mayor frecuencia de da o vascular, nefropatogenicidad, necrosis en islotes pancreáticos y necrosis difusa del tejido linfoide. Estos hallazgos le confieren a la cepa bajo estudio características propias distintivas. Se detectó virus de influenza en pulmón con la técnica de RT-PCR, independientemente de la dosis, y en encéfalo y ri ón en siete de las ocho dosis empleadas, lo cual indica que el virus se replica en estos tejidos; los cambios patológicos observados pueden atribuirse a la replicación viral, sin excluir la participación de otros mecanismos de da o celular.
Detection of bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) in formalin-fixed, paraffin-embedded bovine brain by nested PCR in Colombian cattle Detección de herpesvirus bovino 5 (BoHV-5) en cerebro incluido en parafina y fijado en formalina, por PCR anidada, en bovinos colombianos Detec o de herpesvírus bovino 5 (BoHV-5) em cérebro incluído em parafina e fixado em formalina, pela PCR, em bovinos colombianos
Francisco J Pedraza,Antonio C Alessi,Edel F Barbosa-Stancioli
Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias , 2010,
Abstract: Fifteen cases of viral meningoencephalitis in Colombian cattle were tested by nested PCR analysis for the detection of bovine herpesvirus 5 (BoHV-5). All fatal cases had shown severe neurological signs and had occurred following natural outbreaks of the disease. The neurological infection was histologically characterized by mild to moderate inflammatory changes in the brain and cerebellum, including meningitis, mononuclear perivascular cuffing, gliosis, haemorrhage, and the presence of Gitter cells (macrophages) accompanying large areas of malacia. No intranuclear inclusion bodies were seen in any of the cases. Results from BoHV-5 molecular extraction analyses showed there were five positive cases thus confirming the presence of the virus in Colombia. Quince casos de meningoencefalitis viral en ganado Colombiano fueron analizados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR anidada) para la detección del herpesvirus bovino 5 (BoHV-5). Todos los casos mostraron severos signos neurológicos antes de morir y ocurrieron como brotes naturales de la enfermedad. La infección neurológica fue caracterizada histológicamente por leves a moderados cambios inflamatorios en el cerebro y cerebelo, incluyendo meningitis, manguitos perivasculares, gliosis, hemorragia y la presencia de células Gitter (macrófagos) acompa ando grandes áreas de malacia. No se encontraron cuerpos de inclusión intranucleares en ninguno de los casos. Los resultados del análisis de la extracción molecular de BoHV-5 revelaron la existencia de cinco casos positivos, lo cual confirma la presencia del virus en Colombia. Quinze casos de meningoencefalite viral em gado bovino Colombiano foi analisado pela rea o em cadeia da polimerasa (PCR) para a detec o do herpesvírus bovino 5 (BoHV-5). Todos os casos mostraram graves sinais neurológicos antes de morrer y aconteceram como surtos naturais da doen a. A infec o neurológica foi caracterizada histologicamente por leves a moderados cambios inflamatórios no cérebro e cerebelo, incluindo meningite, manguitos perivasculares, gliose, hemorragia e a presencia de células gitter (macrófagos) acompanhando grandes áreas de malacia. N o se encontraram corpos de inclus o intranucleares em nenhum dos casos. Os resultados da análise da extra o molecular do BoHV-5 por PCR revelaram a existência de cinco casos positivos, os quais confirmam a presen a do vírus na Col mbia.
Identifica??o imuno-histoquímica de Listeria monocytogenes em placentas fixadas em formol e embebidas em parafina
Schwab, Jussara Pires;Edelweiss, Maria Isabel Albano;
Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia , 2003, DOI: 10.1590/S0100-72032003000700006
Abstract: purpose: to identify listeria monocytogenes (lm) in human placentas by immunohistochemistry (ihc) and relate its presence to the histological alterations found on conventional examination, to the pregnancy trimester, age of pregnant women, cases of abortion and premature delivery, and to the occurrence of habitual abortion. methods: a retrospective study was carried out at the pathology service of a teaching hospital in the city of porto alegre in 2000. the paraffin blocks of 254 placentas, obtained from abortion, premature delivery and full-term birth, were analyzed by conventional histology using hematoxylin and eosin (he) staining. the ihc assay consisted of a rabbit anti-listeria polyclonal antibody b65420r (biodesign?) diluted 1:1000, in addition to the avidin-biotin-streptavidin complex; 148 placentas revealed inflammatory disorders, hemorrhage, necrosis and thrombosis. the c2 test was used for statistical analysis. results: listeria monocytogenes was detected in 33.78% of the placentas analyzed by ihc. chorioamnionitis and villitis showed significant statistical difference in the positive placentas. lm occurred in the 1st, 2nd and 3rd trimester of pregnancy. the age of pregnant women, the cases of abortion and/or premature births were not statistically different as to the presence or absence of lm in the placentas. habitual abortions occurred in patients with or without lm in the placental tissue. conclusion: immunohistochemistry may be used to confirm the histopathological diagnosis of listeriosis in all trimesters of pregnancy.
EVALUACIóN DE DOS MéTODOS DE EXTRACCIóN DE ADN A PARTIR DE BIOPSIAS FIJADAS EN FORMALINA Y EMBEBIDAS EN PARAFINA EN CONDICIONES NO óPTIMAS
BUSTAMANTE,JAVIER ANDRéS; ASTUDILLO,MIRYAM; PAZOS,ALVARO JAIRO; BRAVO,LUIS EDUARDO;
Acta Biológica Colombiana , 2011,
Abstract: paraffin wax embedded tissues are an invaluable material for retrospective studies requiring the application of molecular analysis. multiple methods are available to extract dna from these kind of samples. however, the most common methods are slow and the reagents often contribute to the fragmentation of genetic material. in order to optimize the procedure, two methods for dna extraction from paraffin embedded tissue non-optimal conditions were used. 47 blocks containing paraffin-embedded biopsies of pleura, lung and pericardium from 24 patients (66.6% males) older than 18 years, with biopsy proven chronic granulomatous inflammation referred to the department of pathology at university hospital of valle between 2002 and 2007 were selected. each sample was subjected to 10 cuts and was to two methods of dna extraction: 1. conventional and 2. qiaamp-dna mini kit?. the efficiency of the extracted dna, was assessed by spectrophotometry and pcr amplification of a fragment of the housekeeping gene gapdh. the concentration of dna samples extracted by the conventional method was of 65.52 ng/μl ± 11.47 (mean ± se) and the 260/280 absorbance ratio ranged between 0.52 and 2.30 the average concentration of dna of the samples extracted by the commercial method was 60.89 ng/μl ± 6.02 (mean ± se), with an absorbance that fluctuated between 0 and 2.64. the dna obtained was amplified by pcr, of 47 samples extracted by both methods, 25 and 23 respectively the gapdh gene amplified successfully. the methods used to obtain dna showed similar performance, highlighting the potential utility of both extraction methods for the retrospective studies from paraffin embedded tissues in unsuitable conditions.
SPECT : Protocolos técnicos.  [cached]
Nú?ez, Margarita. T.R.I.
Alasbimn Journal , 2000,
Abstract: El presente manual está organizado en forma esquemática y pretende constituir un material de consulta rápida para el tecnólogo en el momento de definir las condiciones de adquisición y procesamiento de los estudios más comunes de tomografía por emisión de fotón único (SPECT).Los parámetros establecidos en estos protocolos son los más aceptados habitualmente y determinados en base a experiencia con estudios clínicos y fantomas, lo cual no significa que sean los únicos correctos. El resultado final puede ser similar utilizando otros protocolos, por lo cual el manual debe entenderse como una guía práctica general que asegura la obtención de estudios de calidad técnica aceptable, aunque no necesariamente óptima.Se notará que se aconseja utilizar una ventana de 15% en el analizador de altura de pulsos. Esto obedece a un actual consenso respecto a la conveniencia de restringir el ancho de la ventana en las cámaras de última tecnología, lo cual permite una mejoría en la resolución de la imagen sin una pérdida significativa de sensibilidad. Una ventana energética de 20%, sin embargo, es todavía lo usual en los procedimientos clínicos y se recomienda para las cámaras más antiguas.La forma de implementar la adquisición suele variar según el tipo de cámara. Algunos fabricantes definen las paradas angulares como número de pasos (habitualmente 32, 64 ó128), mientras otros lo hacen estableciendo un movimiento angular (3 ó 6 grados, lo que equivale a 120 - 60 pasos en una órbita de 360o, ó a 60 - 30 pasos en una órbita de 180o). En este manual utilizamos esta última notación.Si bien presentamos una selección de filtros de reconstrucción para los diferentes estudios de SPECT, aconsejamos a los usuarios definir y experimentar con sus propios filtros adaptados a los distintos equipos de SPECT y a las condiciones particulares de cada caso (características del paciente, tipo de patología, dosis, etc.). Debe recordarse que los diferentes fabricantes de equipos suelen definir matemáticamente los filtros de manera distinta, con resultados por tanto disímiles. Se aconseja utilizar fantomas de SPECT para ensayar la aplicación de diferentes filtros.
Detec??o molecular de herpesvírus bovino 1 e 5 em amostras de encéfalo conservadas em formol e emblocadas em parafina provenientes de bovinos com doen?a neurológica
Arruda, Laura P.;Nakazato, Luciano;Dutra, Valéria;Lemos, Ricardo A.A.;Nogueira, Ana P.A.;Cruz, Raquel A.S.;Pescador, Caroline A.;Colodel, Edson M.;
Pesquisa Veterinária Brasileira , 2010, DOI: 10.1590/S0100-736X2010000800007
Abstract: bovine herpesvirus (bohv) is an important cause of neurological disease in cattle in the midwest brazil. the application of molecular diagnostic techniques represents an important contribution for the study of bohv. this paper describes the detection of bohv-5 and bohv-1 by a specific multiplex pcr assay in 76 paraffin-embedded samples from central nervous system (cns) of cattle with neurological disorders. the samples were divided into 2 groups according to the histological features: group 1 was composed of 40 cases of necrotizing meningoencephalitis (characteristic of bohv infection), and group 2 was composed of 36 cases of nonspecific nonsuppurative meningoencephalitis. positive results for bohv-5 accounted for 40% of the samples in the group 1 and 33% in the group 2. no detection of bohv-1 was recorded.
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