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Eficacia experimental de anticuerpos IgY producidos en huevos, contra el veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox Experimental efficacy of IgY antibodies produced in eggs against the venom of the Peruvian snake Bothrops atrox  [cached]
Julio C. Mendoza,Dan Vivas,Edith Rodríguez,Rosio Inga
Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pública , 2012,
Abstract: Objetivos. Desarrollar un protocolo de inmunización para producir inmunoglobulinas IgY de origen aviar contra el veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox y evaluar la capacidad neutralizante. Materiales y métodos. Se inmunizaron seis gallinas de postura de la raza hy line brown con 500 μg/dosis de veneno de B. atrox en un periodo de dos meses. Cada semana, los huevos fueron colectados para el aislamiento de inmunoglobulinas IgY a partir de la yema, usando dos pasos consecutivos con αcido caprνlico y sulfato de amonio. La detecciσn de anticuerpos se realizσ por inmunodifusiσn doble mientras que el tνtulo y reactividad cruzada se determinaron por las técnicas de ELISA y Western blot. El cálculo de DL50 y de la DE50 del antiveneno IgY producido se realizó utilizando el método de Probits. Resultados. La masa de anticuerpos aislados fue de 8,5 ± 1,35 mg de IgY/mL de yema. Asimismo, la DE50 del antiveneno aviar fue calculada en 575 μL de antiveneno/mg de veneno. Adicionalmente, los ensayos de reactividad cruzada mostraron que el veneno de B. atrox comparte mas epνtopes comunes con el veneno de B. brazili (47%) que con otros veneno del mismo género, en tanto que los venenos de Lachesis muta (19%) y Crotalus durissus (12%) mostraron una baja reactividad cruzada. Conclusiones. Se ha obtenido IgY purificada contra el veneno de B. atrox con capacidad neutralizante y se ha demostrado su utilidad como herramienta inmunoanalítica para evaluar la reactividad cruzada con venenos de otras especies. Objectives. To develop an immunization protocol in order to produce avian IgY immunoglobulins against Bothrops atrox Peruvian snake venom and to evaluate its neutralizing capacity. Materials and methods. Six Hy Line Brown hens were immunized each two weeks using 500μg/doses of B. atrox venom in a period of two months. Each week, eggs were collected for IgY isolation from yolk using two consecutive steps with caprilic acid and ammonium sulfate. Detection of IgY anti-B. atrox were performed by double immunodiffusion, whereas title and cross-reactivity were analyzed using ELISA and Western Blot technics, respectively. Furthermore, letal dose (DL50) and Medium Effective Dose (DE50) were obtained by Probit analysis. Results. As a result of this protocol, chicken IgY’s were obtained in a concentration of 8,5 ± 1,35 mg/yolk mL. DE50 from avian antivenom was 575 μL/venom mg. Cross-reactivity studies showed Bothrops atrox venom share more commom epitopes with Bothrops brazili (47%) than others Bothrops venoms showing Lachesis muta (19%) and Crotalus durissus (12%) venoms a low cr
Caracterización parcial de inmunoglobulinas G (IGy) específicas contra la lectina de Salvia bogotensis a partir de huevos de gallina (Gallus domesticus)  [cached]
Murcia Gutiérrez Hansen Wilber,Pérez Gerardo
Acta Biológica Colombiana , 2004,
Abstract: Partiendo de yemas de huevos de gallinas inoculadas con la lectina presente en Salvia bogotensis, se ensayaron seis métodos de delipidación y extracción de anticuerpos de gallina (IgY). Se escogió la metodología por dilución con agua para continuar con la purificación de anticuerpos, debido a la remoción total de los lípidos de la yema y la alta actividad de las IgY contra la lectina de S. bogotensis. Para la purificación de anticuerpos se utilizaron diferentes métodos cromatográficos: cromatografía de intercambio iónico (DEAE Sephacel), hidrofóbica (Fenil Sepharosa 4B), exclusión molecular (Sephacryl S-200 y S-500), tiofílica (T-gel). Se escogió la cromatografía tiofílica ya que permitió la purificación de anticuerpos, para luego continuar con la caracterización de estos (peso molecular de las IgY y sus subunidades, cantidad de carbohidratos totales, punto isoeléctrico, interacción de las IgY con diferentes lectinas de leguminosas). Los valores de peso molecular del anticuerpo y sus subunidades concordaron con los reportes de la literatura. También se determinó el título de la población de IgY con un valor bastante alto en comparación al título de anticuerpos específicos dirigidos contra otro tipo de antígeno. Debido al bajo rendimiento de la cromatografía tiofílica se realizó una cromatografía de afinidad indirecta sobre aMSB Sepharosa 4B con el fin de purificar IgY específicos y continuar con los ensayos de caracterización. Aunque se obtuvieron fracciones eluídas de esta columna no se detectó proteína. Como alternativa para la purificación de anticuerpos se utilizó un soporte de Sephacryl S-200 a alta fuerza iónica. De esta cromatografía se obtuvieron anticuerpos parcialmente puros. Con esta fracción de anticuerpo se determinó la cantidad de carbohidratos totales, valor que se encontróalgo alejado al reportado en literatura, mientras el punto isoeléctrico de las IgY se encontró en los rangos de pH reportados. Por ensayo de ELISA no se encontraron interacciones inespecíficas entre las IgY y diferentes lectinas de leguminosas. Además, se purificó lectina de S. bogotensis para los diferentes inmunoensayos realizados.
Eficacia experimental de anticuerpos IgY producidos en huevos, contra el veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox
Mendoza,Julio C.; Vivas,Dan; Rodríguez,Edith; Inga,Rosio; Sandoval,Gustavo; Lazo,Fanny; Yarlequé,Armando;
Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pública , 2012, DOI: 10.1590/S1726-46342012000100010
Abstract: objectives. to develop an immunization protocol in order to produce avian igy immunoglobulins against bothrops atrox peruvian snake venom and to evaluate its neutralizing capacity. materials and methods. six hy line brown hens were immunized each two weeks using 500μg/doses of b. atrox venom in a period of two months. each week, eggs were collected for igy isolation from yolk using two consecutive steps with caprilic acid and ammonium sulfate. detection of igy anti-b. atrox were performed by double immunodiffusion, whereas title and cross-reactivity were analyzed using elisa and western blot technics, respectively. furthermore, letal dose (dl50) and medium effective dose (de50) were obtained by probit analysis. results. as a result of this protocol, chicken igy’s were obtained in a concentration of 8,5 ± 1,35 mg/yolk ml. de50 from avian antivenom was 575 μl/venom mg. cross-reactivity studies showed bothrops atrox venom share more commom epitopes with bothrops brazili (47%) than others bothrops venoms showing lachesis muta (19%) and crotalus durissus (12%) venoms a low crossing reactivity, instead. conclusions. using this procedure, we could purify chicken igy with a neutralizant capacity of b. atrox venom which is comparable to the antivenom of equine origin and demonstrate its capacity as a immunoanalitical tool to evaluate the cross reactivity with others peruvian snakes.
OBTENCIóN DE ANTICUERPOS POLICLONALES IgY ANTIPARVOVIRUS CANINO A PARTIR DE YEMA DE HUEVO DE GALLINA
Pinto, J.,Barco, M.,Afanador, M.C.,Merchán, A.M.*;
Universitas Scientiarum , 2005,
Abstract: Inmunizando un grupo de diez gallinas de postura raza Lohmann de 16 semanas de edad con parvovirus canino (CPV) cepa vacunal, se obtuvieron anticuerpos IgY policlonales contra CPV en yema de huevo.En la extracción de los anticuerpos de la yema se requirieron dos pasos, el primero para la remoción de lípidos y el segundo para la precipitación de proteínas. Para la remoción de lípidos se usó el método PBS:Cloroformo y para la precipitación de los anticuerpos solubles (Inmunoglobulinas-IgY) se usó el método de salting-out con sulfato de amonio ((NH4)2SO4). La evaluación del proceso se efectuó empleando el método comercial estándar “EGGstract IgY Purification System ” de PROMEGA.La metodología empleada permitió la obtención de anticuerpos IgY policlonales contra CPV a partir de yema de huevo de gallina en concentraciones altas por mililitro de yema, con una pureza aceptable y títulos altos; los resultados fueron comparables con el método comercial.
Obtención, purificación y caracterización de anticuerpos policlonales IgY desarrollados en gallina, dirigidos contra aislamientos colombianos de Giardia duodenalis
García,Dabeiba Adriana; Nicholls,Rubén Santiago; Arévalo,Adriana; Torres,Orlando; Duque,Sofía;
Biomédica , 2005,
Abstract: introduction. the development of polyclonal antibodies requires laboratory animals, as the usually rabbits, which are bled for obtaining the immunoglobulins.hens are an alternative to developing igy polyclonal antibodies. objective. in the current study, hens were used to develop igy anti- giardia duodenalis antibodies and to evaluate five protocols for its purification. materials and methods. three hens were immunized intramuscularly immunized with colombian giardia duodenalis isolates trophozoites on day 0, 15, 30, 45, 60, 90 and 120. the hen eggs were collected before each immunization, and igy purified from yolk by delipidation (d) and precipitation (p) using five different protocols: m1: (p: ammonium sulfate/d:dextran sulfate-calcium chloride), m2: (d: dextran sulfate-calcium chloride/p: ammonium sulfate), m3: (d: chloroform/p: ammonium sulfate 50%), m4: (d: solution a/p: solution b) and m5: (d: chloroform/p: ammonium sulfate 30%). the immunochemistry evaluation of igy anti- giardia duodenalis was assayed by immunodiffusion, counterimmunoelectrophoresis (cie) and western blot. the purity of igy was assayed by sds-page under reducing and nonreducing conditions. immunoglobulin concentration (mg/ml) was estimated by spectrophotometry and densitometry. results. igy anti- giardia duodenalis by cie had titres up to 1:32. sds-page, without 2- mercaptoethanol showed a 180 kd band characteristic of the whole to igy and, with 2- mercaptoethanol, two bands of 68 and 30 kd, characteristic of its light and heavy chains, respectively. the greatest concentrations of immunoglobulin were recovered by method two (m2), producing 4.6 mg of igy per ml of initial egg yolk. conclusions. the easy and inexpensive production of igy anti- giardia duodenalis in hens is an advantage for using it to develop immunoassays that detect the parasite in fecal eluates.
PURIFICACIóN DE IgY CONTRA LA SUBUNIDAD NR3 DEL RECEPTOR NMDA DE CEREBRO DE RATA
Gina Méndez C,Edgar Reyes M,Raúl Poutou P,Balkys Quevedo H
Revista MVZ Córdoba , 2008,
Abstract: Objetivo. Obtener anticuerpos tipo IgY contra péptidos sintéticos de las subunidades NR3A y NR3B del receptor NMDA de ratas, para reconocer y seguir la expresión de estas subunidades en extractos de cerebro de rata de diferentes edades. Materiales y métodos. Se dise aron dos péptidos empleando los sistemas de la base de datos Entrez y el programa ClustalW-PBIL de alineamientos múltiples contra las subunidades NR3A y NR3B del receptor NMDA; una vez sintetizados por el método SSPS-fmoc fueron utilizados para inocular gallinas (Gallus gallus, variedad Hy Line Brown) de 16 semanas de edad; al cabo de 57 días postinoculación se purificó IgY específica y se enfrentaron a extractos de cerebro de rata postnatal y adulta. Resultados. Se detectaron las subunidades NR3A y NR3B y se relacionó su expresión con la edad del animal; siendo mayor la expresión de la subunidad NR3A en extracto de cerebro de rata postnatal. No se encontró diferencia marcada en la expresión de la subunidad NR3B en las edades mencionadas. Conclusiones. Esta es la primera investigación que emplea proteína nativa para el reconocimiento de la subunidad NR3 del receptor NMDA, lo cual muestra la especificidad de los anticuerpos generados y contribuye con el entendimiento de las funciones de este receptor y su relación con la regulación de la memoria espacial.
Detección de pepsinógeno mediante el uso de antisueros y anticuerpos monoclonales.
Carolina Sierra,Giovanni Suárez,Oscar Orozco
Iatreia , 2000,
Abstract: El pepsinógeno (PGA y PGC) es una aspartato proteasa secretada por células principales gástricas que a pH ácido se convierte en pepsina. Los niveles séricos de dicha enzima se han postulado como indicadores del estado de la mucosa gástrica ya que dependiendo de la patología de base estos pueden encontrarse elevados o disminuidos. Así, en la gastritis superficial y úlcera duodenal los niveles de PGA se encuentran aumentados, mientras que en la gastritis atrófica y cáncer gástrico se encuentran disminuidos. Se planteó como objetivo de este trabajo producir anticuerpos policlonales y monoclonales anti-pepsinógeno con el fin de ser empleados en el dise o de sistemas de cuantificación de pepsinógeno sérico, ya que los sistemas de cuantificación comerciales son muy costosos y de difícil acceso. Para la producción de los anticuerpos se empleó pepsina A porcina como inmunógeno teniendo en cuenta que presenta una alta homología en la secuencia de aminoácidos (86%) con la pepsina A humana y además tienen una estructura secundaria idéntica. Anticuerpos policlonales fueron obtenidos de conejos Nueva Zelanda inmunizados vía subcutánea con pepsina A porcina y los anticuerpos monoclonales a partir de células de bazo de los ratones BALB/c inmunizados con pepsina A vía intraperitoneal. Los anticuerpos tanto policlonales como monoclonales fueron purificados por precipitación con sulfato de amonio y posteriormente cromatografía de intercambio iónico a partir del suero o líquido ascítico respectivamente. Los anticuerpos purificados, tanto policlonales como monoclonales, son capaces de reconocer pepsina porcina y pepsinógeno humano presente en sonicados de biopsias gástricas en ensayos de ELISA y western blot. En ensayos de inmunohistoquímica realizados sobre cortes de biopsias gástricas los anticuerpos monoclonales detectan el pepsinógeno presente en el citoplasma de células principales. Dentro del dise o de sistemas de cuantificación de pepsinógeno se emplearon pruebas de ELISAs tipo competitivo, de inhibición y “sándwich”, así como en pruebas radiométricas. Los ensayos tipo “sándwich” fueron los que brindaron el mayor grado de sensibilidad, logrando generar curvas de calibración empleando diferentes concentraciones de pepsina A porcina, con un limite de detección mínimo de 60 ng/ml de pepsina A. A partir de dicha calibración es posible interpolar los valores de densidad óptica generados por pepsinógeno presente en muestras de suero con el fin de determinar su concentración. Este tipo de pruebas serán de gran utilidad en el seguimiento de pacientes con sintomatología pres
Los anticuerpos y su papel como herramientas analíticas en los ensayos inmunoenzimáticos The antibodies and their role as analytic tools in immunoenzymatic assays  [cached]
Anselmo J. Otero González
Revista Cubana de Medicina Tropical , 2010,
Abstract: En este trabajo se presentó la historia y evolución, desde el descubrimiento, de los anticuerpos, así como la elucidación de su compleja estructura y función que ha servido de base metodológica para crear paradigmas inimaginables en su momento, como la fina especificidad de reconocimiento; también derrumbar otros, aparentemente inamovibles, como la invariabilidad y universalidad del genoma celular. Se revisó la evolución de los sistemas analíticos basados en la reacción antígeno-anticuerpos para llegar al estado actual y problemática de las enfermedades infecciosas y el determinante papel que desempe an en su control la detección y el monitoreo de agentes infecciosos. La extraordinaria capacidad de los anticuerpos para discriminar estructuras antigénicamente similares, les permite ser parte fundamental de los inmunoensayos como herramientas básicas de lo que es hoy día una disciplina productiva muy bien establecida: la inmunotecnología. This paper presented the history and evolution of the antibodies since their discovery. It also elucidated their complex structure and function that have served at a given time as methodological basis for creating unimaginable paradigms such as fine recognition specificity, and also for destroying other apparently immutable ones as invariability and universality of the cellular genome. A review was made of the evolution of antigen-antibody reaction-based analytical systems up to the present, the situation of infectious diseases and the determining role that detection and monitoring of infectious agents play in their control. The extraordinary capability of antibodies to discriminate antigenically similar structures allows them to be fundamental tools in immunoassays and also in a well-established discipline at present, that is, immunotechnology.
Anticuerpos monoclonales contra la gonadotropina coriónica humana (hCG) para su uso en la detección de embarazo Monoclonal antibodies against human chorionic gonadotropin (HCG) for their use in pregnancy detection
Bertha V. Rodríguez Pendás,Rosa de Dios D'Espaux,Julio César Rodríguez García,Celeste Arranz Calzado
Revista Cubana de Endocrinología , 2004,
Abstract: Se reporta la generación de 2 anticuerpos monoclonales (AcM) de ratón dirigidos contra la hormona gonadotropina coriónica humana (hCG), a partir de la inmunización de ratones BALB/c con hCG humana, purificada en el Instituto Nacional de Endocrinología (INEN). Los AcM obtenidos son de la clase IgG y fueron purificados a partir de líquido ascítico, mediante cromatografía de afinidad en proteína G Sepharosa. El estudio de afinidad y especificidad demostró que estos anticuerpos podían ser útiles en ensayos inmunoenzimáticos, con el uso de uno de ellos en el sistema microELISA, de nuestra institución, para la detección cualitativa de embarazo en orina. The generation of 2 mouse monoclonal antibodies directed against the human chorionic gonadotropin hormone (CGh), starting from the immunization of BALB/c mice with human CGh purified at the National Institute of Endocrinology (NIEN) is reported. IgG monoclonal antibodies were obtained. They were purified starting from the ascitic fluid by affinity chromatography in protein G Sepharose. The affinity and specificity study showed that these antibodies could be useful in immunoenzimatic assays, using one of them in the microELISA system of our institution for the qualitative detection of pregnancy in urine.
Determinación de las condiciones de ensayo óptimas en un ELISA para la detección de anticuerpos séricos IgG anti-LPS de Pseudomonas aeruginosa O11.  [PDF]
Tania Valmaseda,Lázaro Alba,Rolando Ochoa,Aniel Moya
Vaccimonitor , 2004,
Abstract: La selección de sueros de donantes sanos para la obtención de una gamma hiperinmune contra la infección por Pseudomona aeruginosa, así como la evaluación de la respuesta inmunológica de cualquier candidato vacunal contra este microorganismo necesita contar en el laboratorio con técnicas estandarizadas. En este trabajo se realizaron los ensayos necesarios para el montaje y laoptimización de un ELISA indirecto para la determinación de anticuerpos séricos de clase IgG anti-LPS de P. aeruginosa O11. Se evaluaron la concentración de recubrimiento, condiciones de bloqueo,dilución de trabajo de las muestras a evaluar y del conjugado con el fin de seleccionar en cada caso las mejores respuestas para el control positivo, el control negativo y el blanco del ensayo. Una concentración de 1,5 μg/mL de LPS O11 en PBS toda la noche a 4 °C como recubrimiento, la necesidad de no incluir un paso adicional de bloqueo y el conjugado humano anti IgG-HRP diluido 1:3000, 1 h a 37 °C resultaron las variables óptimas para el ensayo. Por otra parte, se estableció el rango lineal de la curva del control positivo y se seleccionó la dilución de trabajo 1:100 para las muestras de sueros a evaluar.
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