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SECRETED EXPRESSION OF MANNANASE GENE IN PICHIA PASTORIS AND ANYLYSIS OF ENZYMIC PROPERTIES
甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

QIAO Yu,CHEN Xiao-bing,DING Hong-biao,YUE Ming,
乔宇
,陈小兵,丁宏标,岳明

中国生物工程杂志 , 2006,
Abstract: 采用PCR的方法,以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组DNA为模板,克隆出甘露聚糖酶MAN的成熟肽编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pPIC9K-MAN。重组质粒线性化后用聚乙二醇法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株MAN22。将此菌株在5 L发酵罐中进行高密度发酵,测定酶活最高达1102IU/ml,同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。
SECRETED EXPRESSION OF TRICHODERMA REESEI ENDO- β -GLUCANASE Ⅱ GENE IN PICHIA PASTORIS AND ANYLYSIS OF ENZYMIC PROPERTIES
里氏木霉内切-β-葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

QIAO Yu,MAO Ai-Jun,HE Yong-Zhi,LIU Wei-Feng,DONG Zhi-Yang,
乔宇
,毛爱军,何永志,刘伟丰,董志扬

菌物学报 , 2004,
Abstract: 采用外显子拼接的方法,以里氏木霉Trichoderma reesei基因组 DNA 为模板,克隆出内切-1,4-β-D-葡聚糖酶II基因egl2的全编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pQY2025。重组质粒线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达内切葡聚糖酶II的毕赤酵母工程菌株Gp2025。用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,培养基中内切葡聚糖酶II的活力可达1573.0U/mL,同时对重组内切葡聚糖酶II的性质进行了初步研究。
Yeast Pichia pastoris--a notable heterologous gene expression system]
一种值得注意的基因表达系统——巴斯德毕赤氏酵母

X Dai,
戴秀玉

微生物学报 , 1997,
Abstract: 正当我们热衷于利用大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)等传统表达系统来研究各种基因表达时,国外一些新型表达系统正在悄然兴起。这些系统有着独特的优点,潜力很大,可能对今后基因工程产品的开发和生物技术的发展产生重要作用。其中巴斯德毕赤氏酵母(Pichia Pastoris)特别值得引起我们的注意。本文对该系统作一简要评述。
Expression of Functional Mouse β2-adrenergic Receptor in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris and Activity Determination
β2肾上腺素受体基因在毕赤酵母中的表达及活性测定

HUANG Yuan-yuan,SHEN Hong,WANG Di,YU Hong-xia,SUN Feng-mei,YANG Xiao-feng,YANG Shu-ming,
黄园园
,沈红,王迪,于洪侠,孙丰梅,杨啸枫,杨曙明

中国生物工程杂志 , 2008,
Abstract: 为提高β2-肾上腺素受体(β2AR)表达量,满足生产需求,使其应用到抗体技术上,利用分子克隆技术将β2-肾上腺素受体基因(β2AR)与绿色荧光蛋白基因(eGFP)克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体中。表达载体pPICZαDNAsGFP转化至酵母后,β2AR和eGFP基因与酵母基因重组。利用筛选出的阳性重组子诱导表达β2AR和eGFP的融合蛋白,通过^125I标记的配体结合实验证明获得了有受体活性的融合蛋白。
Expressing the tdh gene of Vibrio parahaemolyticus in Pichia pastoris and its hemolysis activity
副溶血弧菌tdh基因在毕赤酵母中的表达及溶血活性检测

ZHAO Yong-gang,ZHAN Wen-bin,SAREN Gao-w,WANG Jun-wei,WANG Zhi-liang,
赵永刚
,战文斌,萨仁高娃,王君玮,王志亮

海洋科学 , 2010,
Abstract: 通过PCR 技术从副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus, VP)基因组DNA 上扩增耐热溶血素基因tdh, 双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA 中, 构建重组表达质粒pPICZaA-tdh, 经限制性内切酶SacI 线性化后电转化毕赤酵母(Pichia pastoris, P. pastoris)GS115, 经PCR 和测序鉴定耐热溶血素基因成功整合到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行 tdh 的表达, SDS-PAGE 分析证明重组 TDH(thermostable direct hemolysin, TDH) 的分子质量约为23 ku, 经 Western blotting 鉴定VP 抗体能与表达的 TDH 发生特异反应, 说明 tdh 基因在毕赤酵母中的表达是准确的。溶血实验证明了表达的TDH 具有溶血活性。本研究首次应用毕赤酵母表达耐热溶血素基因 tdh, 在培养基中获得分泌表达的耐热溶血素, 为研究tdh 基因的功能奠定了基础。
Biochemical characterization and substrate profile of a highly enantioselective carbonyl reductase from Pichia pastoris
一种来源于毕赤酵母的高对映选择性羰基还原酶的性质及底物谱分析

Laiqiang Tian,Weidong Liu,Xi Chen,Jinhui Feng,Hongjiang Yang,Qiaqing Wu,Dunming Zhu,Yanhe Ma,
田来强
,刘卫东,陈曦,冯进辉,杨洪江,吴洽庆,朱敦明,马延和

生物工程学报 , 2013,
Abstract: 手性醇是一类非常重要的化合物,羰基还原酶催化酮的不对称还原生成对应的手性醇。从毕赤酵母Pichia pastoris GS115基因组数据中找到一个潜在的NADPH依赖的羰基还原酶,研究毕赤酵母P. pastoris GS115中的羰基还原酶。根据其核酸序列设计引物,从P. pastoris GS115基因组中扩增到目的基因ppcr,大肠杆菌BL21 (DE3) 中表达,Ni-NTA纯化,对酶的性质和底物谱进行了研究。PPCR的最适反应温度为35 ℃,最适反应pH为6.0,低于45 ℃时有很好的稳定性。对3-甲基-2-羰基丁酸乙酯的Km和kcat分别为9.48 mmol/L和0.12 s-1。PPCR表现出广泛的底物谱和很高的对映选择性,对醛、α-酮酯、芳香族β-酮酯及芳香族酮都表现出了很好的活性,在测定的底物中,除极少数底物外,ee值均达到97%以上。因此,PPCR具有较好的应用前景。
Recombinant Expression of Pleurocidin cDNA Using the Pichia pastoris Expression System
Olive-Jean Burrowes,Gill Diamond,Tung-Ching Lee
Journal of Biomedicine and Biotechnology , 2005, DOI: 10.1155/jbb.2005.374
Abstract: This research utilized the Pichia pastoris expression system for recombinant expression of cDNA of pleurocidin, a small (2.7 kd) antimicrobial peptide isolated from winter flounder (Pleuronectes americanus). The Pichia vector contains the alcohol oxidase gene promoter (AOX 1), which under the induction of methanol allows for expression of heterologous protein gene inserted downstream in the vector. Two strains of P pastoris were used as host cells, the wild type (P pastoris X-33a(mut
Construction of Pichia pastoris strain expressing salivary plasminogen activator from vampire bat (Desmodus rotundus)
表达食血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的毕赤酵母菌株的构建

Yan Liu,Chang Su,Xiaoshuang Song,Yalan Tang,Zhenhong Bao,
刘堰
,苏畅,宋小双,汤雅岚,包振鸿

生物工程学报 , 2009,
Abstract: 食血蝙蝠(Desmodus rotundus)在吸食大型动物血液时能保持创口处血流的畅通。本研究根据食血蝙蝠唾液中发现的纤溶酶原激活剂(Bat-PA,另称DSPAα1)的全长基因序列(GenBank Accession No.J05082),首次在体外人工合成Bat-PA全长基因并亚克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K上;转化毕赤酵母菌株GS115后,经甲醇诱导获得DSPAα1的分泌型表达,表达条带为47kD;通过抗G418浓度梯度筛选、毕赤酵母中小量表达后SDS-PAGE电泳检测以及纤维平板法测活,筛选出高表达的DSPAα1稳定菌株,对电泳中的目的蛋白条带进行密度扫描测定,产量达到约30mg/L。目前,DSPAα1主要来自哺乳动物细胞,如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、胚胎卵巢肾细胞(BHK)、非洲绿猴肾细胞(COS),代价高昂。在毕赤酵母中生产DSPAα1可以降低成本,增加产率,为探索Bat-PA作为新一代溶栓剂奠定基础。
Apidaecin型抗菌肽在毕赤酵母菌中的基因工程表达
Expression and Identification of Apidaecin in Pichia Pastoris.
 [PDF]

施文,马瑞,周建业,陈莉娅,马媛媛,黄慧敏,张小凤,易根云,李志强
SHI Wen
, MA Rui, ZHOU Jian-ye, CHEN Li-ya, MA Yuan-yuan, HUANG Hui-min, ZHANG xiao-feng, YI Geng-yun, LI Zhi-qiang.

- , 2017, DOI: 10.13701/j.cnki.kqyxyj.2017.05.002
Abstract: 摘要 目的;利用基因工程的方法,在毕赤酵母菌(Pichia patoris,P. pastoris)中成功表达Apidaecin型抗菌肽。方法:利用PCR技术在Apidaecin基因N端插入EcoR I 酶切位点、GST标签(并连接DDDDK肠激酶位点),且在C端插入终止密码子和Not I酶切位点,后将上述片段扩增后与表达载体pPICZαA连接,构建重组表达载体pPICZαA-GST-Apidaecin,并测序鉴定;将pPICZαA-GST-Apidaecin重组质粒电转至P. pastoris X33中并进行发酵表达;表达产物经GST亲和层析纯化后进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,EK肠激酶切除GST标签后进行抑菌实验。结果:SDS-PAGE凝胶电泳结果显示GST-Apidaecin融合蛋白表达的产物条带位于分子量约为28KD处,与理论分子量一致; 抑菌实验表明,用EK肠激酶切除GST融合标签后,Apidaecin型抗菌肽对大肠杆菌有明显的抑菌活性。结论:Apidaecin型抗菌肽在P. pastoris菌中得到成功表达并具有抑菌活性
人源SIRT4蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化
Expression and purification of human SIRT4 protein in Pichia pastoris
 [PDF]

,,,,,,邹叶芳,陈晓雪,,,,,,
- , 2018, DOI: 10.13705/j.issn.1671-6825.2017.11.130
Abstract: 目的:获得表达量较高且有活性的人源SIRT4蛋白。方法:将SIRT4基因克隆到pPICZA载体上,得到重组pPICZA-SIRT4表达质粒。重组质粒线性化后转入到巴斯德毕赤酵母X33感受态细胞中,筛选出阳性菌株。将阳性重组菌株发酵培养,并对诱导剂甲醇浓度进行优化,表达蛋白用镍柱HisTrapTMHP进行纯化,并对表达的蛋白进行活性考察。结果:SDS-PAGE显示表达的SIRT4目的蛋白大小约33 000,与预期蛋白相对分子质量大小相符,进一步利用His标签抗体通过Western blot确认了目标蛋白,并且初步验证了SIRT4的去生物素酰化和去硫辛酰化的活性。结论:成功用巴斯德毕赤酵母表达了有活性的SIRT4蛋白,并且获得酵母表达的最佳诱导条件。
Aim: To obtain high-expression and active human SIRT4 protein.Methods: The SIRT4 gene was cloned into pPICZA vector to obtain the recombinant plasmid pPICZA-SIRT4. The recombinant plasmids were transformed into Pichia pastoris X33 competent cells after being linearized, and the positive strains were screened out. The positive recombinant strain was fermented and cultured, and the methanol concentration of the inducer was optimized. The expressed protein was purified with Ni column HisTrapTMHP and the activity of the expressed protein was investigated.Results: SDS-PAGE showed that the expressed protein SIRT4 was about 33 000, which was consistent with the predicted protein molecular weight. The target protein was further confirmed by Western blot using His-tag antibody. Finally, the debiotinylation and desulfonylation activity of SIRT4 was inspected.Conclusion: The active SIRT4 protein has been successfully expressed with Pichia pastoris and the optimal conditions for the yeast expression has been obtained
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