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Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation as a tool for insertional mutagenesis in thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus
农杆菌介导的获取疏绵状嗜热丝孢菌插入突变体体系的建立

Keywords: 关键词:,农杆菌介导转化,插入突变体,疏绵状嗜热丝孢菌,嗜热真菌

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摘要:【目的】建立疏绵状嗜热丝孢菌的稳定遗传转化体系并获得插入突变体。【方法】利用农杆菌介导的方法建立疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化体系;分别通过Southern杂交、克隆转移DNA(T-DNA)侧翼序列来确定T-DNA 在疏绵状嗜热丝孢菌基因组中的拷贝数和插入位点。【结果】成功建立了可靠的疏绵状嗜热丝孢菌的遗传转化体系。共培养过程中使用萌发孢子是成功建立疏绵状嗜热丝孢菌遗传转化体系的必要条件。疏绵状嗜热丝孢菌萌发的孢子与农杆菌在28℃共培养48h时,转化效率最高。乙酰丁香酮(AS)在农杆菌预培养及疏绵状嗜热丝孢菌萌发的孢子与农杆菌的共培养阶段都是必需的,且在共培养阶段当AS浓度为500 μM时转化效率最高。Southern 杂交验证表明,79.2%的转化子为T-DNA单拷贝插入,且通过热不对称PCR(TAIL-PCR)分析得出T-DNA在该菌基因组中的插入位点是随机的。通过该转化系统筛选到部分表型突变体。【结论】我们首次报道了利用ATMT技术成功转化嗜热真菌-疏绵状嗜热丝孢菌,证明了该方法是一种简单有效的获得插入突变体的方法,并为该嗜热真菌进行基因定位提供了工具。

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